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研究目的1.本研究尝试构建同时具有肝癌主动靶向性、MRI显像及肿瘤抑制药物释放功能的还原响应型纳米诊疗胶束:β-CD(PCL22)14-(-SS-PGlu Gla30)7@SPIO/DOX和β-CD(PCL22)14-(-SS-PGlu Lac30)7@SPIO/DOX。我们对上述胶束进行理化性质及MRI显像能力的研究。2.通过体外细胞实验探索所制胶束对人肝癌细胞(Hep G2)的主动靶向性及细胞摄取机制,探讨其对Hep G2细胞的杀伤作用,证明所制胶束具备成为新型诊疗一体化纳米探针的潜能。研究方法首先通过水浴法生成七(6-叠氮基-6-去氧)-β-环糊精,再以ε-CL为单体、β-CD-(N3)7为引发剂,Sn(Oct)2为催化剂,经开环聚合反应得到β-CD(PCL)14-(N3)7;经过系列化学反应将β-CD(PCL)14-(N3)7转化为γ-(2-叠氮基乙基)-L-谷氨酸环内羧酸酐(AELG-NCA);AELG-NCA经去离子透析、收集透析液,冷冻干燥得到星形聚合物β-CD(PCL)14-(-SS-PAELG)7和β-CD(PCL)14-(PCAELG)7;最后向β-CD(PCL)14-(-SS-PAELG)7和β-CD(PCL)14-(PCAELG)7分别加入炔丙基乳糖和炔丙基半乳糖,合成产物β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(-SSPGlu Lac)7、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7。通过1HNMR和FTIR对β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7四种胶束进行表征;分别利用透射电镜(TEM)及动态光散射(DLS)测定胶束的外观形态、粒径大小及粒径分布;并对胶束的SPIO及DOX包载率进行研究;检测胶束体外MRI显像的T2对比效果。在体外细胞实验中,通过CCK-8法评价含二硫键还原响应型空白胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7和无二硫键非还原响应型空白胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7与Hep G2细胞的生物相容性;再利用同样的方法评价包载DOX的含二硫键还原响应型载药胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@DOX、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@DOX和无二硫键非还原响应型载药胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7@DOX、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7@DOX对Hep G2细胞的杀伤作用。采用普鲁士蓝染色验证所制胶束对Hep G2细胞的靶向性;利用DAPI染核后观察DOX荧光探索Hep G2细胞对胶束的摄取机制及分布情况;通过流式细胞术分析胶束的荧光强度。研究结果1.1H NMR和FTIR结果证实:上述四种纳米胶束构建成功。利用透射电镜(TEM)和动态光散射(DSL)测得β-CD(PCL22)14-(-SS-PGlu Gla30)7的粒径大约为102.4 nm;β-CD(PCL22)14-(PGlu Gla30)7的粒径大约为128.1 nm;β-CD(PCL22)14-(-SS-PGlu Lac30)7的粒径大约为96.5 nm;β-CD(PCL22)14-(PGlu Lac30)7的粒径大约为109.6 nm;可知所制胶束粒径小,均呈球形结构,具备良好的结构稳定性。所制胶束对DOX及SPIO的负载能力强;2.体外MRI成像结果显示:随着Fe离子浓度的逐渐增加,β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@SPIO、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@SPIO、β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7@SPIO、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7@SPIO四种胶束MRI T2WI信号逐渐减低;其对应T2弛豫率分别为:191.5 Fe m M-1·s-1、196.5 Fe m M-1·s-1、185.7 Fe m M-1、239.4 Fe m M-1s-1,证明了上述胶束优良的T2对比效果。3.细胞毒性实验结果:将含二硫键还原响应型空白胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7和无二硫键非还原响应型空白胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7分别与Hep G2细胞共孵育48 h后,CCK-8法计算得出四种空白胶束的细胞存活率均维持在80%以上,生物相容性良好。将包载DOX的含二硫键还原响应型载药胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@DOX、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@DOX和无二硫键非还原响应型载药胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7@DOX、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7@DOX、游离DOX分别与Hep G2共孵育48 h后发现:细胞存活率与药物浓度成呈反比关系,随着抗肿瘤药物DOX浓度的升高,细胞生长抑制作用更加显著;其中游离DOX对Hep G2细胞的杀伤作用最强;含二硫键的还原响应型载药胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@DOX、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@DOX的细胞抑制作用高于无二硫键的非还原型载药胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7@DOX、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7@DOX。4.普鲁士蓝染色实验证明:含二硫键还原响应型纳米胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@SPIO、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@SPIO和无二硫键非还原响应型纳米胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7@SPIO、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7@SPIO均可将SPIO颗粒有效地导入细胞内,证实了以上四种胶束对Hep G2细胞的靶向性。5.荧光观察结果显示:游离DOX、含二硫键还原响应型载药胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@SPIO/DOX、β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@SPIO/DOX和无二硫键非还原型载药胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7@SPIO/DOX、β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7@SPIO/DOX均可被Hep G2细胞摄取;载药胶束主要分布于细胞质内,而游离DOX主要进入细胞核内。6.流式细胞术试验:游离DOX显示最强的荧光强度;与无二硫键的非还原型载药胶束β-CD(PCL)14-(PGlu Gla)7@SPIO/DOX和β-CD(PCL)14-(PGlu Lac)7@SPIO/DOX相比,含二硫键的还原响应型载药胶束β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@SPIO/DOX和β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@SPIO/DOX显示稍强的DOX荧光强度。结论1.本课题成功制备了新型的肝癌还原响应型纳米诊疗胶束:β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@SPIO/DOX及β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@SPIO/DOX,所制胶束具有肝癌靶向性,同时具备MRI显像及抗肿瘤药物智能释放的功能。2.本课题制备的β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Gla)7@SPIO/DOX和β-CD(PCL)14-(-SS-PGlu Lac)7@SPIO/DOX还原响应型诊疗胶束呈大小均一的球状外形,粒径比较小,具备优良的生物相容性、胶体稳定性、环境响应性以及肿瘤抑制作用,可用于MRI成像,具有潜在应用前景。