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研究背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常见的恶性肉瘤,发病人群覆盖各个年龄段,10-20岁这个年龄段发病率最高[1]。据有些学者研究表明其易复发、转移的特性与肿瘤干细胞相关[2,3,4]。近年来,越来越多的学者发现在实体肿瘤中存在着一类特殊的细胞,这些细胞是顶层次结构的亚群,通过不对称分裂,一方面增加实体肿瘤的大小,另一方面继续保持原有分化、分裂的潜质。这类细胞被称为肿瘤干细胞[5]。根据肿瘤干细胞理论,实体肿瘤是由大量具有易构性和异型性的细胞构成,其中有一小部分细胞处于干细胞生态位中,这种环境包含邻近的支持细胞、刺激细胞、微血管、细胞外基质和可溶性因子,如趋化因子和细胞因子[6]。在骨的干细胞生态位中,干细胞存在于干细胞池中,环境相对密闭,是产生耐药及其他干性特征的主要原因[7]。国内外学者陆续从野生型的各种骨肉瘤干细胞中分离出了骨肉瘤干细胞,并对其进行了一定程度的研究,发现了相关的细胞分子表面标志物,并与非肿瘤干细胞作出了相关的比较,提示骨肉瘤干细胞确实存在,并通过与相关正常组织的干细胞作对比,发现了骨肉瘤干细胞的来源[5,8]。EID3是EID家族中的第三个成员,其作用与抑制细胞分化、翻译等有关。目前有关于EID3基因功能研究的文章仅仅有两篇,其主要作用是抑制细胞分化[9,10]。本课题组通过前期研究,挑选合适的骨肉瘤细胞株作为研究对象,并构建过表达EID3的骨肉瘤稳定转染细胞株,检测EID3基因对骨肉瘤MG-63细胞的影响,结果证明,EID3基因可以使骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭、耐药等能力增强,而这些增强的能力,据大量文献报道,均与细胞干性相关,结合文献报道的EID3基因的功能,因此,本课题组大胆猜测,EID3基因可增强骨肉瘤MG-63细胞的干性,查阅相关资料后,并未发现有关EID3增强肿瘤细胞干性的报道;后通过长期液体培养,计算其成瘤率,并与野生型骨肉瘤细胞株作对比,并最终证实EID3对骨肉瘤MG-63干性的影响。最后再利用转录组细胞测序初步探索EID3基因影响干性的可能通路,为进一步探讨EID3对肿瘤干细胞的作用机制打下基础。第一部分构建过表达EID3基因的骨肉瘤MG-63细胞株及初步探索其作用研究目的:1.在正常细胞及各种骨肉瘤细胞株中检测EID3的表达情况,挑选研究的细胞株;2.用阿霉素(Doxorubcin,Dox)处理MG-63,检测Dox对EID3表达的影响;3.初步构建过表达EID3的骨肉瘤MG-63细胞株;4.鉴定过表达EID3的骨肉瘤稳定转染细胞株;5.初步探索EID3对骨肉瘤MG-63细胞的作用。研究方法:1.检测各种骨肉瘤细胞株中EID3的表达情况收集BMSC、MG-63、HOS、U2OS细胞,提取蛋白,利用western-blot检测EID3在各个细胞株中的表达情况。2.Dox对骨肉瘤MG-63细胞中EID3表达的影响将一定浓度梯度的Dox加入骨肉瘤MG-63细胞中,24h后,提取蛋白,利用western-blot检测EID3在不同浓度诱导下的表达情况。3.慢病毒转染慢病毒购于苏州吉玛基因公司,将各个不同滴度的病毒液与细胞共培养,开始出现荧光后,换成正常培养基,大量扩增后,再用嘌呤霉素(Puromycin)进行筛选,获得初步构建完成的细胞株。4.对初步构建完成的细胞株进行验证4.1利用PT-q PCR技术对初步构建好的细胞在转录水平进行验证收集野生型、空转组、过表达EID3组三种骨肉瘤MG-63细胞,进行荧光定量PCR(q PCR),检测EID3在各组细胞中的表达量。4.2蛋白印迹法(western-blot)分析收集野生型、空转组、过表达EID3组三种骨肉瘤MG-63细胞,利用western-blot技术测量EID3在各组细胞中的表达情况。5.CCK-8法测细胞活性将相同数量的EID3过表达组(实验组)、野生型(对照组)种入96孔板中,分别于第0,1,3,5天用cck-8法测每组的细胞活性。6.Transwell法测细胞侵袭能力将相同数量的实验组(过表达组OE)、对照组(野生型WT)种入有基质胶的小室中,24h后,取出小室,固定后染色,计每个小室200倍视野下随机5个视野的细胞数。7.细胞耐药性检测收集野生型及过表达EID3组骨肉瘤MG-63细胞,以相同浓度将细胞接种在96孔细胞培养板内,以相同浓度梯度的阿霉素(Doxorubicin,Dox)进行处理,分别于24h、48h用cck-8法测细胞活性,并计算出半数抑制浓度(half inhibitory concentration IC50)。结果:1.在各株骨肉瘤细胞株中,骨肉瘤MG-63细胞的EID3表达量偏高,最终研究对象确定为骨肉瘤MG-63细胞;2.用不同浓度的Dox处理MG-63细胞,EID3蛋白表达量增加,呈浓度依赖性;3.通过慢病毒感染获得过表达EID3的骨肉瘤MG-63细胞株,并用q RCR及western-blot技术检验后,最终确定EID3过表达细胞株构建成功;4.阿霉素对EID3过表达组骨肉瘤MG-63细胞的半数抑制浓度约为0.333±0.0223ug/m L,对野生型骨肉瘤MG-63细胞半数抑制浓度约为0.115±0.0265ug/m L。表明EID3过表达组骨肉瘤MG-63细胞较野生型对阿霉素具有更强的耐药能力;5.收集EID3过表达组和野生型两组骨肉瘤MG-63细胞,采用transwell法测两组细胞的侵袭能力,EID3过表达组的骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力是野生型的1.75±0.06倍;结论:EID3基因可以明显增强骨肉瘤MG-63细胞增值、耐药、侵袭能力,使骨肉瘤的恶性程度增加第二部分EID3基因对骨肉瘤MG-63细胞对干性的影响研究目的:1.检测EID3基因与肿瘤干性相关性;2.初步推断EID3影响骨肉瘤MG-63细胞干性的可能细胞通路。研究方法:1.收集EID3过表达组和野生型的骨肉瘤MG-63细胞,以相同的浓度在无血清培养基中培养,10-14天后,计算成瘤率。并检验干性相关蛋白及EID3的表达相关性;2.分别培养出EID3过表达组与野生型骨肉瘤MG-63干细胞,利用转录组测序,测出EID3过表达组与野生型骨肉瘤MG-63干细胞的转录组基因,比较分析差异基因,并利用生物学信息,初步探索EID3影响骨肉瘤MG-63细胞干性可能的细胞通路。结果:1.与常规培养条件下的细胞相比,SOX2、EID3在长期无血清液体培养法分选出的细胞中表达升高。过表达组干细胞中SOX2、EID3表达明显较高,过表达组MG-63细胞干性较野生型组明显增强;2.分别培养出EID3过表达组与野生型骨肉瘤MG-63干细胞,转录组测序,分析差异基因,结合生物学信息,在骨肉瘤MG-63细胞中EID3基因可以增强其干性,可能是通过IL-17信号通路实现的。结论:在骨肉瘤MG-63细胞中,EID3可以增强骨肉瘤干性;EID3基因可能通过IL-17信号通路增强骨肉瘤MG-63细胞干性