猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）属于圆环病毒（Circoviridae）科,圆环病毒（Circoviridae）属,其基因组大小约为1.7 kb,是已知病毒中最小的单链环状DNA病毒。根据其血清型的不同,猪圆环病毒可分为Ⅰ型、Ⅱ型和III病毒即PCV1、PCV2和PCV3。PCV2对猪具有强烈的致病性,感染后,可引发猪断奶后多系统衰弱综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）,同时伴有其它疾病的产生。PCV2病毒主要包括四个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3和ORF4）,ORF1编码复制相关蛋白（Replication-related protein,Rep）,其作用为参与病毒复制,ORF2编码衣壳蛋白（capsid protein）即Cap蛋白,ORF3编码促进宿主细胞凋亡相关蛋白,ORF4编码抑制半胱天冬酶活性与CD4和CD8T淋巴细胞的相关蛋白。Cap蛋白大小为30k Da左右,包含4 k Da左右的信号肽以及26 k Da左右的核心部分,核心部分包含PCV2的主要抗原中和表位,在合适的环境中,Cap蛋白能自组装成病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。因此,PCV2的VLPs在开发疫苗以及建立稳定的血清检测方面具有良好的应用前景。在蛋白表达中,常用的表达系统有原核表达系统、酵母表达系统以及真核（昆虫细胞及家蚕等）表达系统。原核表达系统,昆虫杆状病毒-家蚕幼虫表达系统是目前蛋白表达应用研究中较为常用的两个表达系统,原核表达系统在高通量表达外源蛋白方面其优势明显,且大肠杆菌具有价廉易于培养等优点。但原核表达的重组蛋白,易形成包涵体,缺乏后加工以及修饰等。昆虫杆状病毒-家蚕幼虫表达系统其优势为安全、高效,可容纳多个以及大片段的基因,不感染人或者其他哺乳动物,且作为真核表达系统,其对目的蛋白有翻译后修饰加工,增强蛋白活性等作用。本研究通过生物信息学分析,优化PCV2Cap序列在E.coli BL21（DE3）菌株和昆虫细胞中的表达,利用杆状病毒多基因表达系统高效表达Cap蛋白。将优化后的cap基因克隆至原核表达载体pET30a以及真核转移载体p FBDM中,分别引入6×His标签,以绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,e GFP）作为真核表达的荧光报告基因。通过转化,筛选,鉴定得到重组表达菌株BL21（DE3）-pET30a-PCV2Cap。设置不同温度（16,25和37℃）和IPTG（0.4,0.6,0.8和1.0）浓度对重组菌株进行诱导表达,优化表达条件,证明在37℃和0.8m M的IPTG浓度的条件下得到最佳表达条件。利用转移载体p FBDM含有Tn7转座位点的特性,将重组转移载体p FPCV2Cap-e GFP通过Tn7转座分别导入Ac Multi Bac和Bm Multi Bac载体中,获得E.coli r Sw106-Ac-p F-PCV2Cap-e GFP和E.coli r Sw106-Bm-p F-PCV2Cap-e GFP重组菌株。由于缺失asd基因,重组菌株E.coli r Sw106-Ac-p F-PCV2Cap-e GFP和E.coli r Sw106-Bmp F-PCV2Cap-e GFP在侵染蛋白的介导下,无需脂质体转染,可直接感染昆虫细胞Sf9和Bm N。在感染昆虫细胞72 h后,观察绿色荧光,获得重组病毒Ac MNPV-PCV2Cape GFP和Bm NPV-PCV2Cap-e GFP,收集培养基上清,离心得到重组病毒。通过westernblot鉴定,证明获得大小约25.7 k Da左右的目的蛋白,重组病毒构建成功且Cap蛋白在昆虫细胞中稳定表达。将重组病毒Bm NPV-PCV2Cap-e GFP注射5龄起家蚕幼虫,4 d可观察到蚕体产生绿色荧光,对蚕皮和血淋巴进行western-blot检测,得到25.7k Da左右的目的条带,证明Cap蛋白在家蚕幼虫中成功表达。将原核表达得到的包涵体蛋白进行变性处理,利用Ni柱亲和层析对Cap蛋白进行纯化,复性。收集家蚕幼虫表皮进行处理,纯化。在适宜条件下,得到体外自组装的病毒样颗粒（VLPs）。将VLPs免疫小鼠后得到多克隆抗体,经western-blot鉴定和酶联免疫吸附试验（ELISA）证明得到抗PCV2Cap的多克隆抗体。综上所述,对PCV2Cap基因进行密码子优化,通过基因合成得到Cap基因,构建原核表达系统和杆状病毒—家蚕幼虫表达系统,优化表达条件和纯化条件,最终形成预期的VLPs,成功免疫小鼠并得到多克隆抗体。