鹰嘴豆转化体系及CaLTP、CaCP功能的初步研究

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鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)是世界第三大豆类作物,营养丰富,具有“营养之花、豆中之王”的称号。鹰嘴豆适应性强,具有耐干旱、耐贫瘠、抗病、抗虫等特点,因此鹰嘴豆也是一种重要的种质资源,为作物抗性改良提供重要的基因资源。目前尚未有利用分子育种来培育鹰嘴豆优良品种的报道,其中鹰嘴豆的遗传转化效率低等问题是研究抗逆功能、培育优良品种的技术难点。本研究探索建立鹰嘴豆再生体系及遗传转化体系,并对CaLTP和CaCP的功能进行了初步的研究。鹰嘴豆再生条件:10%NaClO消毒鹰嘴豆种子5 min,以SIM1培养基(4.42 g/L MSB5+2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂粉)诱导鹰嘴豆产生丛芽,以RIM培养基(4.42 g/L MSB5+4 u M IAA+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂粉)诱导鹰嘴豆枝条生根,共获得12株再生植株。选择3 mg/L的Basta作为鹰嘴豆遗传转化的筛选压;通过含GUS基因的载体进行农杆菌介导转化,检测13个鹰嘴豆品种的转化效率,发现YZD125的GUS染色率最高(34.69%)。植物脂质转运蛋白(Lipid Transfer Proteins,LTPs)是一类小分子碱性分泌型蛋白,具有抗寒、抗旱、耐盐、耐热等作用。从鹰嘴豆克隆到CaLTP的c DNA序列,全长650 bp,ORF 351 bp,编码116个氨基酸。CaLTP蛋白N端具有信号肽,存在跨膜结构域和AAI蛋白结构域;CaLTP蛋白N端存在一个大的疏水腔,可用于与脂质的结合,以转运脂质。分别以渗透胁迫(30%PEG 6000)、盐胁迫(200 m M NaCl)和100μM ABA处理鹰嘴豆植株3 h和24 h,以水处理的为对照,从叶片提取总RNA,采用实时荧光定量PCR检测基因的相对表达量。ABA、PEG和NaCl处理24 h后,CaLTP表达量显著增加,表明CaLTP表达受ABA、渗透胁迫和盐胁迫的诱导。构建CaLTP过表达载体,采用农杆菌介导转化法分别转化鹰嘴豆和紫花苜蓿(Medicago sativa L.),转基因鹰嘴豆再生植株已处于生根阶段,转基因紫花苜蓿再生植株已移栽成活29株,获得4株过表达CaLTP紫花苜蓿植株。半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Protease,CP)是生物体内一类重要的蛋白水解酶,参与植物体内多种生理过程。从鹰嘴豆克隆了1175 bp的CaCP c DNA序列,其ORF长1101 bp,编码366个氨基酸组成的蛋白。CaCP蛋白N端具有信号肽,还具有组织蛋白酶前肽抑制剂结构域(Cathepsin propeptide inhibitor domain,Inhibitor_I29)和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的保守结构域(Pept_C1);亲水性氨基酸较多,属于亲水蛋白。ABA处理24 h后CaCP的表达量升高,表明CaCP表达受ABA诱导;渗透胁迫处理3 h时CaCP表达量升高,但处理24 h时表达量明显下降;盐胁迫处理则抑制CaCP的表达。构建CaCP过表达载体,采用农杆菌介导法转化紫花苜蓿,获得32株转基因紫花苜蓿再生植株,经鉴定获得6株过表达CaCP紫花苜蓿植株。
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