巨桉(Eucalyptus grandis)是世界重要的速生与能源树种,但其栽培种多为冷敏感型,且不耐高盐、干旱等逆境。NAC转录因子是植物特有的大型转录因子家族之一,不仅参与植物的生长发育过程,还与逆境胁迫的适应密切相关。通过对巨桉NAC转录因子的研究,挖掘参与逆境响应的关键NAC,有望为巨桉抗性分子辅助育种提供理论支持。通过生物信息学手段,在巨桉全基因组范围内鉴定出NAC转录因子基因成员,并在此基础上结合前人的研究筛选出了其中的SNAC(stress responsive NAC)类基因,并对其成员的基因结构、组织特异性表达以及低温、高温、干旱、高盐等非生物逆境和ABA、MeJA处理下的表达情况进行了分析。从中选择了EgrNAC1、EgrNAC6进行拟南芥异源转化,进行基因功能研究及其所参与的非生物胁迫响应机制的探讨。同时,结合生物信息学方法、转录组分析与酵母双杂技术,初步构建了EgrNAC1、EgrNAC6参与低温响应的模型。主要结果如下:1.从巨桉基因组中鉴定得到166个NAC转录因子家族基因成员,并在与其他物种中参与非生物逆境胁迫的NAC转录因子序列比对的基础上,从中筛选出50个SNAC类基因。巨桉166个NAC基因在11条染色体上都有分布,其中1号、6号、7号、9号和10号染色体分布相对密集;组织特异性表达分析表明:NAC转录因子在不同组织中表达差异可分成四大类,分别对应在成熟叶片、茎尖与嫩叶、韧皮部、未成熟和成熟木质部表达量较高,暗示其在不同组织中有特定表达的基因簇,协同参与、调控各组织器官的生长发育及应激反应。根据巨桉50个SNAC类基因在低温、高温、干旱、高盐、ABA、MeJA六种处理条件下的定量表达数据,分析了它们与不同非生物逆境因子的响应关系。根据响应逆境因子个数,将其分成四大类:第Ⅰ类基因共计17个,都能响应6种逆境因子,根据响应情况又细分为上调诱导型、高温下调型、无规律型;第Ⅱ类19个基因,特征为响应5种逆境条件,根据对激素的反应,又细分为响应两种激素型、只响应ABA型、只响应MeJA型;第Ⅲ类9个基因响应3、4种逆境因子,细分为响应两种激素型、只响应ABA型、只响应MeJA型;第Ⅳ类5个基因不受激素调控,但其成员至少能响应4种非生物逆境因子中2种及以上的胁迫因子。2.通过异源转化拟南芥,研究了转基因株系与野生型在低温响应方面的差异,发现超表达EgrNAC1、EgrNAC6能通过CBF途径增强拟南芥抗冻表型,在-6℃处理条件下,相对于野生型,EgrNAC1、EgrNAC6超表达转基因株系成活率从30%提升到80%以上。这两个基因参与拟南芥低温响应过程中,都能通过提高CBF1、CBF2的表达量,使下游低温响应基因RD29A表达上调,从而参与低温响应。3.EgrNAC1、EgrNAC6参与ABA、高盐与干旱响应。EgrNAC1的超表达降低了拟南芥对ABA的敏感程度,但减弱了植株抗旱能力和耐盐能力;EgrNAC6超表达降低了拟南芥对ABA的敏感程度,但同时增强了植株的抗旱与耐盐能力。从EgrNAC6超表达拟南芥转基因株系的低温转录组数据中,我们发现EgrNAC6还可能受到MAPK信号途径的调控,另外还可能涉及氧化磷酸化水平的调控、光合作用的下调、硫苷化合物的积累等,以此提高植株对低温、干旱和高盐的抵抗能力。4.通过生物信息学手段,我们预测了EgrNAC1、EgrNAC6与其他基因表达蛋白之间潜在的互作及调控关系,借助酵母双杂技术,我们对其中20个候选蛋白进行了验证,发现其中18个能与EgrNAC1或EgrNAC6发生互作的蛋白。根据这18个基因的低温转录组数据,将其分成3类:前期响应蛋白(RING-ZFP、HOMEZ1、MYB、C2H2、HOMEZ2、AP2/B3)、中期响应蛋白(Dof1、Obp、SNAC3、ERF018)与后期响应蛋白(AP2、NAC1、NAC6、WRKY、AN1-ZFP、SNAC35、SP、Dof2),分别对应调控前期响应基因、中期响应基因、后期响应基因。5.综合研究的结果,我们提出了一个初步的EgrNAC1、EgrNAC6参与低温响应模型:当低温来临时,首先由ABA和MAPK信号途径接收与传递信号,将信号传递至EgrNAC1、EgrNAC6,使EgrNAC1、EgrNAC6的表达量上升;EgrNAC1、EgrNAC6通过招募其他NAC或者转录因子,调控低温相关基因的表达;EgrNAC1、EgrNAC6也能通过上调CBF1、CBF2的表达量,提升低温响应下游基因RD29A等的表达,产生氧化磷酸化水平下降、光合作用关闭、抗氧化酶活性上升、硫苷类物质上升等一系列生理生化层面上的改变,提高植物对低温的适应性。