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类风湿关节炎(RA)是一种原因不明的慢性自身免疫性疾病,主要影响关节并最终导致其破坏。现在,位于滑膜边缘的RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)被认为是RA病理生理过程的关键参与者,研究表明RA-FLSs与肿瘤细胞具有许多相似的特性,包括不受接触抑制的过度增殖,及其对软骨的迁移和侵袭能力。酸敏感离子通道(ASICs)作为细胞外酸性PH的关键受体,在各种炎症,缺血,缺氧,肿瘤等疾病中具有不同的表达,并且与疾病潜在的发病机制有关。诸多研究表明ASIC1a参与了肝癌,胃癌等肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此,我们旨在探索ASIC1a是否也参与了类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)这种类肿瘤细胞的迁移和侵袭,从而造成软骨和骨质破坏。目的:本课题通过检测在RA-FLSs以及佐剂性关节炎(AA)大鼠中ASIC1a的表达情况,从而探讨ASIC1a是否调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)迁移和侵袭从而导致滑膜对关节软骨的侵袭性破坏,以及酸化激活ASIC1a是否是通过介导Ca2+内流从而活化Rac1信号,进而促进RA-FLSs迁移和侵袭。方法:采用免疫组化法检测ASIC1a在RA患者和正常人滑膜组织中的表达水平。采用Western blot法,免疫荧光法,q RT-PCR检测ASIC1a在RA滑膜成纤维细胞和正常人滑膜成纤维细胞中的表达情况。采用弗氏佐剂建立佐剂性关节炎AA大鼠模型,处理组的AA组在造模成功后第14天注射ASIC1a的特异性阻断剂PCTX-1或阳性药醋酸曲安奈德(1mg/kg)或PBS,采用HE染色,甲苯胺蓝染色法观察大鼠关节处滑膜增生,浸润,侵袭软骨现象,Western blot和免疫组化检测大鼠关节滑膜中迁移和侵袭相关基因的表达。使用ASIC1a sh RNA的慢病毒质粒转染RA-FLSs,构建ASIC1a基因沉默组以及过表达组。用q RT-PCR,western blot和ELISA法评估不同PH下和ASIC1a-RNAi或过表达ASIC1a转染的RA-FLSs中靶基因和蛋白的表达。通过划痕和transwell法检测不同组别中RA-FLSs迁移和侵袭能力。将RA-FLSs分为对照组,PH6.0酸化组以及PCTX-1+PH6.0酸化组。分别使用钙离子荧光探针Fluo-3 AM标记每组RA-FLSs中的钙离子,采用激光共聚焦显微镜观察细胞中钙荧光强度变化。将RA-FLSs分为PH7.4,PH6.0和PH6.0+ASIC1a-RNAi或过表达ASIC1a组。再使用Rac1活性检测试剂盒检测RA-FLSs中Rac1的活性。在BAPTA-AM螯合细胞内钙离子后,检测RA-FLSs中Rac1的活性变化。采用Rac1特异性抑制剂NSC23766抑制Rac1活性后用q RT-PCR,western blot和ELISA法评估不同PH下和ASIC1a-RNAi或过表达ASIC1a转染的RA-FLSs中靶基因和蛋白的表达,通过划痕和transwell法检测细胞迁移和侵袭。结果:我们的结果显示ASIC1a在RA滑膜组织和RA-FLSs中高表达。PCTX-1对ASIC1a的抑制作用可降低滑膜侵袭,并能保护AA大鼠关节软骨,降低MMP2,MMP9,p-FAK的表达。此外,ASIC1a-RNAi和PCTX-1抑制ASIC1a后,酸诱导的RA-FLSs的侵袭和迁移降低,而过表达-ASIC1a则使之升高。MMP2,MMP9,p-FAK的表达也与此相一致。ASIC1a介导Ca2+内流和Rac1的激活,而胞内钙螯合剂BAPTA-AM降低Rac1的活性。同时,Rac1特异性阻断剂NSC23766抑制了RA-FLSs的迁移侵袭以及MMP2,MMP9,p-FAK的表达。总之,这项研究表明ASIC1a可能是通过Ca2+/Rac1途径引起的滑膜侵袭的主要调节因子。结论:1.ASIC1a能够调控RA-FLSs的迁移和侵袭。2.ASIC1a通过Ca2+/Rac1信号通路调控RA-FLSs的迁移和侵袭。