鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）属于黄病毒科,黄病毒属病毒。2010年该病在我国爆发以来,给我国养殖行业带来了重大的经济损失。在黄病毒的病毒基因组中,非结构蛋白5（NS5）是最大、最保守的病毒蛋白,根据其功能可以分为N端甲基转移酶区域（Methytransferase,MTase）和C端RNA依赖性RNA聚合酶区域（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）。在RdRp区域中,包含有一段核定位信号序列以及与RdRp酶活性有关的7个基序。其中,基序C（motif C）位于RdRp酶活性中心位点,对病毒基因组复制具有重要意义。但是,目前对DTMUV NS5的亚细胞定位情况以及RdRp活性区域中各个基序对病毒增殖的影响尚不明确。为了揭示DTMUV RdRp区域的部分功能,为后续鸭坦布苏病毒的防治提供理论依据,本论文对DTMUV NS5的亚细胞定位和含RdRp酶活性中心位点motif C的功能进行探讨。1.DTMUV NS5的亚细胞定位为了明确DTMUV NS5的亚细胞定位情况,首先通过对NS5蛋白进行原核表达及纯化,并制备了鼠抗DTMUV NS5多克隆血清;在此基础上,用DTMUV感染或者用NS5真核表达质粒转染鸭胚成纤维细胞和仓鼠肾细胞,收集感染或者转染细胞后不同时间点的细胞样品,通过间接免疫荧光的方法,用鼠抗DTMUV NS5多克隆血清确定DTMUV NS5蛋白定位在细胞质中;为了排除NS5可以在细胞核中快速穿梭而无法明确DTMUV NS5入核的可能性,本研究进一步使用核输出蛋白抑制剂处理细胞,再次确定了DTMUV NS5只定位在细胞质中。2.DTMUV RdRp的motif C区域对病毒增殖的影响为了研究RdRp酶中不同基序对病毒的影响,本研究选择了RdRp酶活性中心位点所在的关键区域,即基序C进行研究。本研究通过在motif C上构建丙氨酸单点突变的复制子,筛选到了两个减弱病毒基因组复制的位点V671A和V672A;基于筛选到的这两个位点,利用反向遗传操作技术成功构建并拯救了两株感染性克隆,即r DTMUV-NS5-V671A和r DTMUV-NS5-V672A,用于探讨这两个位点对重组病毒的基因组稳定性、体外生长特性和致病性的影响。结果表明,拯救的重组病毒r DTMUVNS5-V671A和r DTMUV-NS5-V672A重组病毒传至第5代,基因组稳定而无续发突变;重组病毒引起的细胞病变能力下降;经鸭胚攻毒试验证实,与野生型相比,重组病毒r DTMUV-NS5-V671A和r DTMUV-NS5-V672A导致鸭胚死亡时间延迟,并且这两株重组病毒引起雏鸭的临床病变与野生型相似、组织载量与野生型无明显差异。综上,本研究证实了DTMUV NS5定位在感染细胞的细胞质;筛选到RdRp区域motif C中两个减弱病毒复制的位点V671A和V672A,构建并成功拯救了两株感染性克隆r DTMUV-NS5-V671A和r DTMUV-NS5-V672A,证明了V671A和V672A这两个位点不仅影响病毒的基因组复制,并且也影响病毒增殖。