论文部分内容阅读
目的:近年来,肺癌成为世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重危害人民身体健康。因此找寻肺癌发生发展过程中的有效生物学标志,实现精准的早期预防和合理治疗,对于降低肺癌发病及死亡率具有重要意义。有研究表明吸烟是肺癌发生的主要危险因素。卷烟中含有多种致癌物,而在这些化合物中,已显示尼古丁与肺癌之间的关系较为密切。尼古丁作为烟草植物中的主要生物碱,虽然不能在人类中引起肿瘤发生,但可以参与细胞增殖,凋亡抑制,细胞迁移和血管生成等多个生物学过程,增加肿瘤迁移以及侵袭能力,从而影响包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内多种肿瘤的上皮间充质转化（EMT）过程。本研究应用肺癌临床病例研究与体外细胞实验相结合的方法,探讨原癌基因PPP1R13L可变剪接异构体及PPP1R13L-SP1负反馈环是否可以在尼古丁所致肺癌细胞的EMT过程中发挥一定的调节作用,从而对肺癌的转移侵袭等生物学过程产生重要影响。研究方法:1.生物信息学分析（1）通过Xena及TCGA数据库分析PPP1R13L与SP1基因在NSCLC中的表达水平以及与临床病理特征的关联性。（2）通过TSV db数据库分析PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV基因在NSCLC中的表达水平。（3）通过UCSC及Transfac等数据库预测调控PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV基因表达的SP1结合位点。2.肺癌临床病例研究（1）签署知情同意书后,收集50例术中切除肺癌肿瘤组织,通过qRT-PCR方法检测PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV及SP1的mRNA表达水平。3.体外细胞实验研究（1）将人肺腺癌细胞系A549及人肺鳞癌细胞系LK2给予不同浓度尼古丁染毒处理细胞24 h,检测细胞的迁移及侵袭能力,检测PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV、SP1及EMT相关指标的mRNA和蛋白表达水平,分析在肺癌细胞发生EMT时,PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV以及SP1的表达调节模式;COIP实验分析SP1蛋白能否与PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV蛋白进行结合;使用ChIP实验分析SP1作为转录因子能否调控PPP1R13L-L基因的表达。（2）采用A549细胞构建si-SP1的转染细胞模型,分析对细胞迁移、侵袭能力的影响,以及对PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV、SP1及EMT相关指标的mRNA和蛋白表达水平的影响。（3）采用A549细胞构建si-PPP1R13L-L及si-PPP1R13L-SV的转染细胞模型,分析对细胞迁移、侵袭能力的影响,以及对PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV、SP1及EMT相关指标的mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:1.在NSCLC中,PPP1R13L基因（PPP1R13L、PPP1R13L-L以及PPP1R13L-SV）在癌和癌旁内的表达有所差异,通过探究其与病理特征之间的相关性,发现其表达与肺癌患者的吸烟史以及肿瘤分期具有明显关联性（P<0.05）;SP1与PPP1R13L在癌旁中低表达,癌中高表达,二者呈现正相关关系;PPP1R13L-L及PPP1R13L-SV的转录起始位点区域附近均具有SP1的结合位点。2.肺癌病例研究结果显示:PPP1R13L-L在男性、有吸烟史、LUSC或肿瘤≧3cm的肺癌患者中显著高表达（P<0.05）;PPP1R13L-SV在男性、有吸烟史或肿瘤Ⅲ/Ⅳ期人群中显著高表达（P<0.05）;SP1的mRNA表达水平在LUSC中升高（P<0.05）。SP1 mRNA表达在肺癌组织中与PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV呈正相关关系（P<0.05）。3.与对照组相比,使用0.1～10 μM尼古丁处理A549及LK2细胞可以显著提高细胞的迁移能力（P<0.05）;1 μM尼古丁处理A549及LK2细胞24h后细胞的侵袭能力显著提高（P<0.05）;在A549及LK2细胞中尼古丁处理组PPP1R13L-I和PPP1R13L-SV的蛋白表达水平升高,N-cadherin及β-catenin的mRNA及蛋白表达水平均升高,SP1及E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平均降低（P<0.05）;使用1μM尼古丁处理A549及LK2细胞,与对照组相比,尼古丁处理组会发生明显的核转移现象。SP1蛋白与PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV蛋白均可以结合。SP1作为转录因子,可以调控PPP1R13L-L的基因转录。4.当A549细胞中SP1表达降低,细胞的迁移及侵袭能力显著增强（P<0.05）;PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV及E-cadherin 的 mRNA 及蛋白表达水平降低（P<0.05）,N-cadherin及β-catenin的表达水平升高（P<0.05）;β-catenin蛋白会发生明显的核转移现象。5.在A549细胞中,与空载质粒组相比,si-PPP 1R13L-L及si-PPP 1R13L-SV组中,细胞的迁移及侵袭能力显著降低（P<0.05）;SP1及E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平均升高（P<0.05）,N-cadherin及β-catenin的表达水平降低（P<0.05）;β-catenin蛋白不会发生核转移现象。结论:1.应用尼古丁染毒处理肺癌细胞系（A549、LK2）,发现高表达PPP1R13L-I和PPP1R13L-SV均与肺癌细胞EMT的发生密切相关。2.PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV可变剪接异构体均可调控SP1表达从而间接影响肺癌细胞的EMT过程,PPP1R13L可能作为预测吸烟型肺癌转移的效应生物标志物。3.SP1作为转录因子促进PPP1R13L-L的基因转录,可以与PPP1R13L-L构成负反馈环,在肺癌细胞的EMT过程中发挥重要的调控作用。