转录水平调控是联系基因和蛋白表达的纽带,mRNA选择性剪接是一种调控基因表达的重要转录后调控机制,能使相对有限的基因表达出非常复杂的蛋白产物,已经成为真核基因表达调控的研究热点之一。选择性剪接与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞通过选择性剪接改变某些基因的表达方式,使其转化为癌基因;或者通过选择性剪接机制改变抑癌基因的表达,使其失去肿瘤抑制作用;从而促进自身的生长增殖,逃避凋亡信号和免疫监视。选择性剪接对于肿瘤的意义研究,已经成为生命科学领域方兴未艾的研究热点。PIAS3作为促癌因子STAT3蛋白的抑制蛋白,发挥显著的抑癌功能。PIAS3能够阻止STAT3与下游靶基因启动子的结合,抑制STAT3的转录活性。作为转录调控因子,PIAS3参与对多种肿瘤关联信号,如MITF、NFκB、Smad信号的调节。研究表明,过表达PIAS3能够抑制多种肿瘤的增殖信号;提高肺癌、卵巢癌和子宫内膜癌细胞的药物敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。然而,在不同的肿瘤中,PIAS3表达的研究结果令人费解;人们发现在多种癌组织中的PIAS3表达低于正常组织;也有研究表明,PIAS3在多种癌组织中表达上调;PIAS3在不同肿瘤,甚至相同肿瘤的表达的矛盾性,提示了PIAS3的表达可能存在更复杂的调节机制,需要深入研究。目前研究表明,小鼠PIAS3基因编码两个剪接型蛋白PIAS3α(64KD)和PIAS3β(68KD);而人类的所有组织中只有一种PIAS3(68KD)。在本论文中,我们创新性的发现了一种存在于多种肿瘤细胞中的人类PIAS3短型异构体;这种肿瘤型PIAS3异构体是人类正常PIAS3基因选择性剪接的产物。我们探讨了这种选择性剪接的调控机制,并揭示了这种选择性剪接对肿瘤发生的生理意义。首先,我们发现人类肿瘤细胞表达一种缺失87-121位氨基酸的短型PIAS3剪接异构体。我们利用Western blot方法检测了人类前列腺组织和几种肿瘤细胞内PIAS3的表达情况;在人类前列腺增生组织中,我们检测到一条68KD大小的PIAS3蛋白条带的表达,而在所有五种肿瘤细胞中,我们检测到一条小于68KD的蛋白条带。通过克隆和测序,证明肿瘤细胞PIAS3缺失了位于EXON2上一段105bp的碱基序列(PIAS3Δ段mRNA),编码87-121位共35个氨基酸。我们对人类两种PIAS3蛋白命名进行区分,将前列腺组织中68KD的蛋白命名长型PIAS3L,将各种肿瘤细胞中出现的64KD短型蛋白命名为PIAS3S。通过序列比对,证明人类两种PIAS3蛋白(PIAS3L和PIAS3S)与小鼠的两种PIAS3(PIAS3β和PIAS3α)的蛋白序列高度同源。然后,我们对人类两种PIAS3蛋白存在的机制进行了研究,发现了一种特异性的PIAS3选择性剪接机制。我们对PIAS3L和PIAS3S差别的Δ段mRNA 105bp碱基序列进行生物信息学分析,发现这段序列具备内含子的GT-AG边界法则特点,而且含有分支点A的结构特征,提示这段序列是一种潜在的内含子。我们发现在这个潜在的内含子序列中,存在着STAT3和雄激素受体AR潜在的结合位点的重合交叉。进而我们发现,长型PIAS3L的表达水平与组织/细胞内AR的表达水平一致,而短型PIAS3S的表达水平与组织/细胞内STAT3的表达水平一致。通过过表达和基因沉默实验,我们证明AR上调PIAS3L的蛋白水平和mRNA水平,而STAT3上调PIAS3S的蛋白水平和mRNA水平。接着,通过RIP实验,我们证明了STAT3和AR是新型的RNA结合蛋白,具有和PIAS3Δ段的105bp mRNA的结合能力,而AR能够拮抗STAT3的结合。进一步通过COIP实验,我们发现STAT3具有U2AF35的结合能力。因此,我们提供了一种STAT3介导的肿瘤型PIAS3S的形成机制的假说,即STAT3结合PIAS3Δ段mRNA,招募U2AF35到潜在内含子3’端位点的,从而促进PIAS3Δ段mRNA剪接,产生PIAS3S mRNA和肿瘤型PIAS3S蛋白;而AR结合在Δ段mRNA上从而阻止了STAT3和此段RNA的结合,抑制了PIAS3的选择性剪接。这是一种尚未见报道的新型剪接调控方式。在此基础上,我们揭示了这种PIAS3选择性剪接的病理生理学意义。STAT3信号和AR信号的异常活化是肿瘤,特别是前列腺癌发生的必要条件。我们比较了不同PIAS3剪接异构体对STAT3/AR信号通路的调控,发现长型PIAS3L显著抑制STAT3和AR介导报告基因的转录活性,而短型PIAS3S失去了抑制功能,PIAS3Δ段本身就发挥信号的抑制作用。进一步通过免疫共沉降实验和GST Pulldown实验发现,PIAS3Δ段在体内外都具有显著的STAT3/AR结合能力;长型PIAS3L与STAT3/AR具有显著的结合作用,而PIAS3S与STAT3/AR的结合作用很弱。我们通过免疫荧光实验研究了不同PIAS3剪接异构体对STAT3/AR细胞内定位的影响,我们发现PIAS3Δ段的存在是STAT3/AR不能进入细胞核的重要原因,这些结果证明PIAS3两种异构体的差异序列-PIAS3Δ段是PIAS3L发挥抑制STAT3/AR信号功能的关键结构域。进而,我们研究了不同PIAS3异构体对肿瘤细胞增殖与肿瘤发生的影响。我们发现PIAS3L或PIAS3Δ段具有显著地抑制前列腺癌细胞活力和克隆形成能力,抑制增殖标志蛋白BCL-2、PCNA、Ki67、CyclinD1和Survivin的表达。同时裸鼠异种移植实验表明,与对照组比较,短型PIAS3S对肿瘤发生和生长影响不显著,而长型PIAS3L和PIAS3Δ段显著地抑制了肿瘤的发生,PIAS3L和PIAS3Δ段接种后肿瘤的发生率仅为对照组的1/6,而且体积很小,提示了PIAS3Δ段对肿瘤发生的显著抑制效应。为了揭示不同PIAS3亚型与人类肿瘤的关联,我们收集了63例临床不同分期的前列腺癌样本,并利用特异识别长型PIAS3L的Δ段的抗体检测了前列腺癌组织内长型PIAS3L的表达水平。我们发现,在前列腺癌组织中,随着代表肿瘤恶性度GLEASON评分增高,长型PIAS3L表达减少,而PIAS3总体表达并未减少,提示了随着肿瘤恶性度的增加,PIAS3发生了选择性剪接增强。通过对63例患者十年间的生存率分析发现,PIAS3L强染色组生存率高,弱染色组生存率低,两者差别显著(p=0.019),说明具有Δ段的长型PIAS3L是肿瘤患者生存良好的预测指标。我们还比较了前列腺增生组织与前列腺癌组织中长型PIAS3L表达水平与STAT3和AR表达的关联,发现随着肿瘤的进展,PIAS3L表达减少,STAT3和AR入核增加。这些结果证明,PIAS3Δ段的存在是PIAS3L抑制肿瘤信号活化,保证良好生存率的基础。本论文提供了一种肿瘤关联的PIAS3 mRNA选择性剪接的新机制,揭示了这种选择性剪接关联功能域(PIAS3Δ段)对PIAS3发挥肿瘤抑制功能的意义,为肿瘤的预测和治疗提供了新的靶点和靶向。