研究背景感音神经性聋是一种较为常见的声波感受和声波传导障碍性疾病,多为重度耳聋。该病的病变常常发生于柯蒂氏器的内外毛细胞、听神经及各级听中枢,患者对于声音的感受与神经冲动的传导发生障碍,从而引起听力的下降。感音神经性耳聋极大的影响了患者的生活质量。感音神经性耳聋分为感音性耳聋(病变位于毛细胞,又称耳蜗性聋)和神经性耳聋(病变位于听神经及其传导通路,又称蜗后性聋)。蜗后性耳聋由于神经细胞的缺乏自我修复的能力而很难治愈。对于感音神经性聋的恢复策略,最新的探索表明干细胞植入是潜在的治疗手段。干细胞具有多向分化能力,有分化为新的毛细胞、神经细胞和支持细胞的潜能。许多研究都表明,Wnt信号通路对于神经干细胞的增殖发挥着决定性作用。并且,Wnt信号通路的激活有可能可以使非神经元细胞再次进入细胞周期转变为神经元细胞,这就使得治疗蜗后性聋成为了可能。Wnt信号通路是一种在进化中高度保守的信号通路,在多种生物学过程中发挥着重要作用。Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌的与细胞膜上的受体结合,激活下游的信号通路,调节靶基因的表达从而影响着极细胞、干细胞等的细胞增殖、分化与凋亡的过程。通路的异常激活往往与肿瘤的发生有关。Wnt信号通路分为两种,经典的Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路。β-连环蛋白的富集与入核是经典Wnt信号通路激活的标志。β-连环蛋白入核后与转录因子结合从而调节下游目的基因的表达。而非经典的Wnt信号通路,不依赖于β-连环蛋白,是由其他的一些蛋白或离子参与构成。耳蜗螺旋神经节细胞的缺失可引起神经性耳聋的发生。而有大量研究表明,耳毒性药物、噪声、缺氧、衰老等常见损伤,均可造成小鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞的凋亡,造成耳聋。而目前对于耳毒性药物的研究,较多集中在顺铂等药物。紫杉醇由于其与顺铂常常联合使用,其耳毒性往往为顺铂所掩盖,研究较少。而研究也表明紫杉醇确实具有神经毒性,可以猜测紫杉醇的耳毒性是对耳的神经细胞造成了影响。螺旋神经节作为听觉通路的第一级神经元,有理由怀疑紫杉醇对于螺旋神经节有损伤作用而这一作用正是它耳毒性的原因。本研究通过组织培养的方式来探究紫杉醇对于螺旋神经节是否具有独立的损伤作用,并探讨Wnt信号通路对于紫杉醇的作用是否具有一定的影响。实验目的以C57BL/6小鼠作为研究对象,探讨紫杉醇本身是否对小鼠耳蜗螺旋神经节产生独立的损伤作用,若有损伤,则进一步探讨其机制及Wnt信号通路在此过程中的作用。实验方法1.选取出生后3天(p3)野生型的C57BL/6品系小鼠为研究对象,取小鼠耳蜗中转(带螺旋神经节)分组进行原代培养。2.分别使用不同浓度紫杉醇培养,利用MTT法测定细胞存活程度,并选取合适浓度进行进一步实验。将小鼠耳蜗中转随机分为四组,分别使用培基(不加药的空白对照)、紫杉醇、紫杉醇+Wnt信号通路激动剂(Wnt3a)、紫杉醇+Wnt信号通路抑制剂(IWP2)来处理中转(带螺旋神经节)48h,之后分别进行免疫荧光染色和TUNEL染色,观察螺旋神经节及神经纤维的变化。使用蛋白印迹试验(Westernblot)来印证免疫荧光染色的实验结果。3.紫杉醇腹腔注射一月龄小鼠,测听后解剖,取耳蜗制作冰冻切片进行免疫荧光染色,观察螺旋神经节的变化。实验结果1.MTT结果显示,1μl紫杉醇即可造成细胞存活率的下降,紫杉醇对螺旋神经节的损伤呈现浓度依赖,后续实验选用30μl浓度进行。免疫荧光染色显示,紫杉醇组螺旋神经节结构被破坏,细胞数量减少,神经纤维数量减少。2.免疫荧光染色显示紫杉醇组螺旋神经节细胞形态破坏,出现了胞质致密,染色质边集,核固缩及凋亡小体等凋亡表现。而TUNEL染色证实了凋亡的存在。3.免疫荧光染色显示紫杉醇组螺旋神经节细胞Caspase-3染色阳性。蛋白印迹试验也证实了 Caspase-3的表达增多。4.加入Wnt信号通路激动剂组螺旋神经节细胞数量介于对照组和紫杉醇组之间,形态较紫杉醇组稍好,神经纤维基本整齐排列。加入抑制剂组螺旋神经节结构严重破坏,细胞数量大量少,形态破坏较为严重,凋亡明显,神经纤维破坏严重。5.腹腔注射紫杉醇造模后的一月龄小鼠测听结果显示与正常一月龄小鼠并无显著差别,但冰冻切片显示耳蜗螺旋神经节神经细胞存在损伤和凋亡。结论1.紫杉醇对螺旋神经节细胞有明显损伤作用。2.损伤作用通过激活Caspase-3,诱导凋亡实现。3.Wnt信号通路对于紫杉醇的损伤具有一定的保护作用。