论文部分内容阅读
目的:随着全球人口老龄化,骨质疏松成为人们所面临的一个重要的问题。绝经后妇女,很可能由于缺乏雌激素而患有骨质疏松。骨质疏松是以骨量减少,骨微观结构退化为特征致使骨脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼代谢疾病。在一些临床研究中,激素替代疗法（hormone replacement therapy, HRT）能够阻止绝经后妇女骨量的丢失,并且提高骨密度。但长期使用有促子宫内膜增生、增加冠心病、脑卒中、肺栓塞、乳腺癌等发生率的副作用。植物雌激素是一种来自植物的有弱雌激素样作用的物质,它的结构与己烯雌酚类似,它包括四个类别:异黄酮类（Isoflavones）,香豆素类（Coumarin）,木脂素类（Lignans）,霉菌类（Mycoestrogen）。因为植物雌激素有雌激素样作用但是并没有雌激素的副作用,所以人们用植物雌激素,例如大豆异黄酮等来防治骨质疏松。中药（traditional chinese medicine, TCM）在治疗骨折方面有着悠久的历史。补骨脂和菟丝子是祖国医学中治疗骨折的常用药,近代人们用它们来防治骨质疏松。异补骨脂素和山萘酚是分别从补骨脂和菟丝子中提取的单体化合物,属于植物雌激素中香豆素类植物雌激素和黄酮类植物雌激素。我们预期异补骨脂素和山萘酚可能有防治骨质疏松的作用。本实验采用大鼠成骨细胞体外培养的方法,应用分子生物学等实验技术,在细胞和分子水平研究植物雌激素异补骨脂素和山萘酚对大鼠成骨细胞增殖、分化,分泌蛋白I型胶原（COL I）和细胞因子中转化生长因子（TGF-β1）,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）表达的影响,来进一步探讨植物雌激素在骨代谢中的作用,并为抗骨松新药开发,中药现代化提供实验依据。方法:1采用改良的组织块法分离培养新生（24 h）SD大鼠颅骨成骨细胞。将不同浓度的异补骨脂素(10-9 mol/L10-5 mol/L)及山萘酚(10-9 mol/L10-5 mol/L)加入到培养成骨细胞的培养基中,用倒置显微镜观察细胞形态和数量的改变。2采用噻唑蓝比色（MTT）法,以雌激素（estrogen, E2）为阳性对照,考察了加药后,异补骨脂素和山萘酚24 h ,48 h,72 h对大鼠成骨细胞增殖的影响。3采用对硝基苯二钠基质动力学法（pNPP）法,以雌激素为阳性对照,检测了异补骨脂素和山萘酚在24 h,48 h和72 h对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。4采用放射免疫法（radioimmunoassay, RIA）测定了含异补骨脂素培养基的大鼠成骨细胞在48 h和72 h时骨钙素的含量。5采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase PCR ,RT-PC R）方法,以雌激素为阳性对照,检测含有异补骨脂素培养基的大鼠成骨细胞在72 h时I型胶原（COL I）mRNA,转化生长因子（TGF-β1）mRNA,巨噬细胞集落刺激因子,（M-CSF ） mRNA的表达。结果:1阳性对照雌激素对成骨细胞增殖与分化的影响1.1阳性对照雌激素组细胞形态学观察刚接种的成骨细胞成球形,悬浮于培养液中,逐渐沉降贴壁,24 h细胞贴壁展开。展开细胞形态不规则,呈多角形,培养72 h～96 h,细胞为长梭形、条索状,融合成片,分界较为模糊。培养120 h,细胞呈铺路石状。如果继续培养,细胞逐渐形成细胞小结,随后胶原堆积,钙盐沉积,形成不透光的矿化结节。连续培养20代,可见细胞体积增大,胞质稀薄,细胞分裂速度大大下降等细胞衰老的表现。雌激素处理组与空白对照组相比,在72 h～96 h时,细胞更加密集,细胞间隙少,形态无明显差异。1.2阳性对照雌激素组对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度雌激素培养基中培养24 h ,在雌激素浓度为1×10-5 mol/L,1×10-7 mol/L和1×10-8 mol/L时有促大鼠成骨细胞增殖作用（P<0.05）;培养48 h ,在雌激素浓度为1×10-6 mol/L,1×10-8 mol/L和1×10-9 mol/L有促大鼠成骨细胞增殖作用（P<0.05）; 72 h ,在雌激素浓度为1×10-5 mol/L 1×10-7 mol/L与空白对照组相比有显著的促进大鼠成骨细胞增殖的作用（P<0.05）。1.3阳性对照雌激素组对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响培养48 h ,与空白对照组比较,雌激素组浓度为1×10-5 mol/L～1×10-6 mol/L有明显的促进碱性磷酸酶活性的作用（P<0.05）;培养72 h ,雌激素浓度为1×10-6 mol/L～1×10-9 mol/L有促进碱性磷酸酶活性的作用（P<0.05）。2香豆素类植物雌激素异补骨脂素对成骨细胞增殖与分化及分泌的蛋白I型胶原（COL I）mRNA和细胞转化生长因子（TGF-β1）mRNA,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）mRNA表达的影响2.1异补骨脂素组细胞形态学观察与雌激素组类似。2.2异补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度异补骨脂素培养基中培养24 h ,在异补骨脂素浓度为1×10-9 mol/L有促进大鼠成骨细胞增殖作用（P<0.05）;培养48 h ,在异补骨脂素浓度为浓度为1×10-6 mol/L 1×10-9 mol/L有促进大鼠成骨细胞增殖作用（P<0.05）; 72 h ,在异补骨脂素浓度为1×10-9 mol/L与空白对照组相比有显著的促进大鼠成骨细胞增殖的作用（P<0.01）。2.3异补骨脂素对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响培养24 h ,与空白对照组比较,浓度为1×10-5 mol/L异补骨脂素组有明显的促进大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性的作用（P<0.05）;培养48 h ,与空白对照组比较,异补骨脂素组浓度为1×10-9 mol/L有明显的促进大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性的作用（P<0.01）;培养72 h ,异补骨脂素组浓度为1×10-9 mol/L有促进大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性的作用（P<0.05）。2.4异补骨脂素对大鼠成骨细胞的骨钙素的影响与空白对照组相比,异补骨脂素组在48 h和72 h表现出明显的促进大鼠成骨细胞分泌骨钙素的作用, 48 h有效浓度为1×10-7 mol/L 1×10-9 mol/L（P<0.05）,72 h有效浓度为1×10-7 mol/L 1×10-9 mol/L（P<0.05）。2.5异补骨脂素对大鼠成骨细胞分泌的I型胶原（COL I） mRNA表达的影响培养72 h后,空白对照组COL I mRNA/GAPDH mRNA的相对表达量为0.3103,异补骨脂素组COL I mRNA /GAPDH mRNA的相对表达量为0.7323,与空白对照组相比,有明显促进COL I mRNA表达的作用（P<0.01）;和空白对照组相比雌激素组（0.8030）有明显促进COL I mRNA表达的作用（P<0.01）,但是雌激素组和异补骨脂素组之间没有明显的差别（P>0.05）。2.6异补骨脂素对大鼠成骨细胞分泌的转化生长因子（TGF-β1） mRNA表达的影响培养72 h后,空白对照组的TGF-β1 mRNA/GAPDH mRNA的相对表达量为0.9256,异补骨脂素组TGF-β1 mRNA /GAPDH mRNA的相对表达量为1.0470 ,与空白对照组相比,能够显著的上调TGF-β1 mRNA的表达（P<0.01）;和空白对照组相比雌激素组（1.0741）能够显著的上调TGF-β1 mRNA的表达（P<0.01）,但是雌激素组和异补骨脂素组之间没有明显的差别（P>0.05）。2.7异补骨脂素对大鼠成骨细胞分泌的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）mRNA的表达的影响培养72 h后,空白对照组的M-CSF mRNA /GAPDH mRNA的相对表达量为1.0487 ,异补骨脂素处理组M-CSF mRNA/GAPDH mRNA的相对表达量为0.8877 ,与空白对照组相比,能明显能够下调M-CSF mRNA的表达（P<0.01）;和空白对照组相比,雌激素组（0.9177）能够显著的下调TGF-β1 mRNA的表达（P<0.01）,但是雌激素组和异补骨脂素组之间没有明显的差别（P>0.05）。3黄酮类植物雌激素山萘酚对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响3.1山萘酚组细胞形态学观察与异补骨脂素组类似。3.2山萘酚对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度山萘酚的培养基中培养24 h ,浓度为1×10-5 mol/L有显著的促增殖作用（P<0.01）;培养48 h ,浓度为1×10-5 mol/L和1×10-9 mol/L显著的促增殖作用（P<0.01）,培养72 h ,浓度为1×10-9 mol/L显著的促增殖作用（P<0.01）。3.3山萘酚对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响培养48 h ,与空白对照组比较,浓度为1×10-9 mol/L山萘酚组有明显的促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的作用（P<0.01）;培养72 h ,还是浓度为1×10-9 mol/L的山萘酚组有促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的作用（P<0.01）。结论:1一定剂量的异补骨脂素和山萘酚可以促进成骨细胞的增殖与分化。一定剂量的异补骨脂素促进成骨细胞分泌蛋白I型胶原（COL I） mRNA的表达,上调细胞转化生长因子（TGF-β1） mRNA的表达,并且能够下调巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） mRNA的表达,说明异补骨脂素可能通过促进骨形成和抑制骨吸收来防治骨质疏松的,而山萘酚可能通过促进骨形成来防治骨质疏松。2异补骨脂素和山萘酚对大鼠成骨细胞作用的有效浓度均为1×10-9 mol/L。3植物雌激素很可能是补肾中药发挥防治骨质疏松作用的物质基础之一。4研究异补骨脂素和山萘酚对骨质疏松的防治作用为抗骨松的药物开发和中药现代化提供了实验依据。