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目的研究妊娠期镉暴露是否通过mi RNAs参与子代卵巢颗粒细胞凋亡的调控及其调控机制,为阐明镉诱导卵巢颗粒细胞损伤的表观遗传学机制提供科学依据。方法第一部分妊娠期镉暴露F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关mi RNAs的筛选SPF级成年SD大鼠受孕后随机分为四组,孕鼠于妊娠第1天至分娩分别连续暴露于0、0.5、2.0、8.0mg/kg Cd Cl2溶液,灌胃染毒,每日一次。F1代雌鼠常规饲养至成年,于动情期提取卵巢颗粒细胞,稳定培养后收集细胞。利用微阵列芯片技术检测0和8.0mg/kg组mi RNA表达谱。通过mi RNA芯片、数据库和文献,综合筛选出妊娠期镉暴露致F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关mi RNAs。使用数据库对筛选出的mi RNAs预测靶基因并进行生物信息学分析,包括GO和Pathway分析。q RT-PCR检测妊娠期镉暴露F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞mi RNAs表达水平。第二部分Mi R-16、mi R-181b和mi R-92a在镉诱导人卵巢颗粒瘤细胞(COV434)凋亡中的影响将COV434作工具细胞,分别构建慢病毒介导敲低COV434-tudmi R-16、COV434-tudmi R-181b、COV434-tudmi R-92a细胞株。实验分6组:(1)COV434(2)COV434+Cd(3)COV434-C+Cd(4)COV434-tudmi R-16+Cd(5)COV434-t udmi R-181b+Cd(6)COV434-tudmi R-92a+Cd,20μM Cd Cl2处理12h后收集细胞。QRT-PCR检测Bcl2 m RNA表达水平;Western blot检测BCL2蛋白表达水平;双染法流式细胞术和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况。荧光素酶报告基因实验验证mi R-92a和Bcl2靶向关系。第三部分F0代大鼠妊娠期镉暴露对F2代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响在F1代模型的基础上,选取0和8.0mg/kg组,继续与健康雄鼠合笼受孕,受孕F1代雌鼠正常分娩得F2子代。将F2代雌鼠常规饲养至成年,于动情期提取卵巢颗粒细胞,稳定培养24h后收集细胞。双染法流式细胞术检测细胞凋亡率;透射电镜观察细胞亚显微结构;q RT-PCR检测Bcl2、Bax、Caspase 3、Caspase 8基因m RNA表达水平;Western blot检测BCL2、BAX、CASPASE3、CASPASE8蛋白表达水平;q RT-PCR检测mi R-16-5p、mi R-181b-5p和mi R-92a-2-5p表达水平;q RT-PCR检测Wt-1基因m RNA表达水平。结果第一部分妊娠期镉暴露F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关mi RNAs的筛选在mi RNA芯片表达谱中,以Fold Change≧1.5或≦0.67且p<0.05为阈值筛选显著差异表达mi RNAs,得到7个mi RNAs;以FC值≥1.7为阈值进行挑选差异表达mi RNAs,得到75个mi RNAs,最终将82个mi RNAs作为mi RNA芯片提示的信息纳入备选。针对Bcl2、Bcl2l1和Bcl2l2凋亡基因预测靶mi RNAs,将SUM≥2的靶mi RNAs纳入备选。最后查阅文献,将与细胞凋亡相关且研究较多的mi RNA纳入备选。结合上述三个来源提示,最终筛选出可能与妊娠期镉暴露致F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关的31个mi RNAs。对筛选出的31个mi RNAs进行靶基因预测和生物信息学分析。GO分析结果显示,这31个mi RNAs的靶基因表达产物主要参与细胞质、细胞核、细胞膜等细胞组分的构建;主要参与蛋白质结合、转录活性、DNA结合等分子功能;生物学过程主要归类于转录调控、细胞增殖、细胞凋亡等方面。Pathway分析结果显示这些mi RNA的靶基因主要富集于癌症信号通路、癌症中的蛋白多糖、磷脂酰肌醇信号通路等117条信号通路(p<0.05)。与对照组比较,各组mi R-92a-2-5p、mi R-16-5p表达水平均上调且差异有统计学意义(p<0.05);中、高剂量组mi R-181b-5p、mi R-628表达水平均上调且差异有统计学意义(p<0.05);高剂量组mi R-1-3p表达水平上调且差异有统计学意义(p<0.05),其变化趋势与mi RNA芯片结果基本一致。第二部分Mi R-16、mi R-181b和mi R-92a在镉诱导人卵巢颗粒瘤细胞凋亡中的影响与COV434组相比,COV434+Cd组BCL2蛋白表达水平下调且差异有统计学意义(p<0.05)。与COV434+Cd组相比,COV434-C+Cd组Bcl2基因m RNA和蛋白表达水平下调且差异有统计学意义(p<0.05),但COV434-C+Cd组未明显导致Bcl2表达水平上调,对本研究结果不产生负向影响;COV434-tudmi R-16和COV434-tudmi R-92a组Bcl2基因m RNA和蛋白表达水平均上调且差异有统计学意义(p<0.05);COV434-tudmi R-181b+Cd组Bcl2基因m RNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(p>0.05)。与COV434组相比,COV434+Cd组细胞凋亡率上调且差异有统计学意义(p<0.01)。与COV434+Cd组相比,COV434-C+Cd组细胞凋亡率差异无统计学意义(p>0.05);COV434-tudmi R-16和COV434-tudmi R-92a组细胞凋亡率均下调且差异有统计学意义(p<0.05);COV434-tudmi R-181b+Cd组细胞凋亡率差异无统计学意义(p>0.05)。COV434+Cd组与COV434-C+Cd组Hoechst33258染色呈强蓝色荧光的细胞核数量较多,而COV434组、COV434-tudmi R-16+Cd组、COV434-tudmi R-181b+Cd组、COV434-tudmi R-92a+Cd组的细胞核多呈均匀的蓝色,强蓝色荧光的细胞核偶有散在分布。与Luc对照组相比,共转染mi R-92a和野生型Bcl2 3’UTR区荧光表达质粒是,其荧光素酶活性显著降低且差异有统计学意义(p<0.05)。第三部分F0代大鼠妊娠期镉暴露对F2代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响与对照组相比,实验组细胞凋亡率差异无统计学意义(p>0.05)。透射电镜观察对照组和实验组卵巢颗粒细胞均细胞膜规整、核膜完整、核仁清晰,线粒体丰富,但实验组卵巢颗粒细胞出现明显的线粒体肿胀。与对照组相比,实验组Bcl2、Bcl-2/Bax m RNA和蛋白表达水平均上调且差异有统计学意义(p<0.01);Bax m RNA表达水平差异无统计学意义(p>0.05)而蛋白表达水平下调且差异有统计学意义(p<0.01);Caspase3 m RNA表达水平均上调且差异有统计学意义(p<0.01),CASPASE3蛋白表达水平下调且差异有统计学意义(p<0.01);Caspase8 m RNA表达水平上调且差异有统计学意义(p<0.01),CASPASE8蛋白表达水平差异无统计学意义(p>0.05)。与对照组相比,实验组mi R-16-5p和mi R-181b-5p表达水平均上调且差异有统计学意义(p<0.01);实验组mi R-92a-2-5p表达水平下调且差异有统计学意义(p<0.01)。与对照组相比,实验组Wt-1 m RNA表达水平上调且差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.Mi R-92a-2-5p、mi R-16-5p、mi R-181b-5p、mi R-628和mi R-1-3p可能促进妊娠期镉暴露F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。2.妊娠期镉暴露上调mi R-16和mi R-92a靶向下调Bcl2参与F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。3.F0代妊娠期镉暴露后F2代成年大鼠卵巢颗粒细胞未出现明显凋亡改变,mi R-92a的下调可能具有重要意义。