黄曲霉毒素B1（aflatoxin,AFB1）是化学物质中致癌性最强的一种真菌毒素,常见于谷物、粮油和加工食品中,对人和动物的健康具有极大的威胁,尤其是对肝脏的损害。曲霉属真菌可以在适当的自然条件下生长并产生毒素的性质,增加了控制AFB1污染谷物和食品的难度,人和动物也不可避免的通过饮食摄入AFB1进而造成肝脏损伤。壳寡糖（chitooligosaccharides,COS）是由甲壳素通过酶或化学脱乙酰作用生成的衍生物壳聚糖进一步水解得来的,其溶解性好,生物利用度高,并且具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性。以大鼠肝细胞（BRL 3A细胞）为实验对象,研究COS预处理对AFB1诱导大鼠肝细胞毒性损伤的干预作用及可能机制。采用CCK-8法测定AFB1和COS分别作用于细胞24 h的细胞活力,AFB1对细胞的IC50为15.86μmol/L,COS对细胞的无损害作用浓度COS浓度≤125μmol/L。测定了COS预处理细胞6 h后再加AFB1处理细胞24 h的细胞毒性、氧化应激和抗氧化酶活性指标,发现20μmol/L COS的干预效果最为明显。COS预处理可以缓解AFB1（≤10μmol/L）诱导的细胞存活率的降低,并通过降低细胞内LDH释放量、CYP1A2活性、ROS水平和MDA含量来干预AFB1引起的细胞毒性和氧化应激损伤。同时,COS还提高II相代谢酶SOD、CAT和GST的活性,提升细胞自身抗氧化能力,进而干预细胞被AFB1诱导引起的氧化损伤。为了进一步评估AFB1诱导大鼠肝细胞毒性的损伤程度以及COS预处理对其的干预作用,观察COS预处理对AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡的干预情况。5、10μmol/L AFB1均诱导了细胞内线粒体膜电位的下降、DNA损伤后细胞核的皱缩以及细胞凋亡率的升高。而使用20μmol/L COS预处理缓解了线粒体膜电位的下降,减少了DNA损伤引起的细胞核致密浓染,降低了细胞凋亡率的升高。根据前两章实验的结果,采用RT-q PCR技术检测相关基因的表达量,研究COS预处理干预AFB1诱导细胞氧化损伤和凋亡的可能机制。AFB1作用于细胞时,降低了Keap1-Nrf2信号通路核心基因（Nrf2、Keap1）和下游基因（Ho-1、Nqo1）的相对表达量,并诱导促细胞凋亡基因Bax的表达。COS预处理能够将Keap1和Nrf2的m RNA相对表达水平恢复至正常水平,并显著促进受Nrf2调控下游基因Ho-1和Nqo1的m RNA表达,推测COS可能通过激活Keap1-Nrf2信号通路来缓解AFB1诱导大鼠肝细胞引起的氧化应激。此外,COS降低了AFB1诱导的Bax的表达量升高,进而降低Bax和Bcl-2表达量的比值,缓解其对线粒体的损伤,从而降低了线粒体介导的细胞凋亡率。通过RNA-seq进一步研究COS预处理对AFB1诱导细胞毒性损伤干预作用的可能通路途径。结果表明,COS预处理能够干预AFB1诱导细胞引起的基因差异性上调和下调程度,p53、MAPK和Hippo信号通路可能参与了AFB1诱导细胞生长抑制和凋亡。COS可能通过细胞色素P450对外源物质的代谢作用通路、药物代谢-细胞色素P450通路和p53信号通路来干预AFB1诱导细胞毒性损伤,其中p53信号通路参与COS干预AFB1诱导的细胞凋亡。此外,COS还可能激活了PI3K-Akt信号通路,进一步帮助其激活Keap1-Nrf2信号通路,促进Nrf2的核转移,启动Keap1-Nrf2通路下游的Ho-1和Nqo1的表达,提高II相代谢酶活性,从而提高细胞自身的抗氧化能力,减轻由ROS、MDA引起的氧化损伤。