研究背景股骨头坏死是多种因素共同作用下导致股骨头的供血减少进一步导致软骨和下骨细胞凋亡或死亡,从而使股骨头的力学强度及韧度下降,最终发展成为股骨头塌陷以及髋关节发生功能性障碍的一种骨科疾病。现有研究已经对股骨头的缺血坏死的病因、病理及发病机制做了大量研究,但其确切的发病机制及其相关的调控基因尚不明确,所以寻找调控股骨头坏死的调控基因和作用靶点至关重要。目前研究认为引起股骨头坏死主要有相关因素。首先是脂类代谢紊乱,包括PPARy以及HDAC9c-S等基因的表达异常。PPARy是成脂相关的转录因子,在人体脂肪组织系统中广泛存在,糖皮质激素可激活促脂肪转录因子,并可以特异性的连接在PPARy基因启动子区域的相应的位点上,从而上调PPARy的表达水平,当PPARγ表达量增大时,可调控骨髓中的间充质干细胞向脂肪细胞方向大量分化,导致股骨头中的脂肪细胞大量堆积,造成脂肪细胞的体积变大,股骨头的压力增强,进一步压迫动脉,导致股骨头处供血不足,进而压迫静脉,干扰股骨头的静脉回流,使得成骨细胞分化不足,最后导致股骨头坏死的发生。BMP-2是骨骼生长的重要因子,骨诱导活性很强,在脊椎动物骨基质中普遍存在,对骨骼的修复具有明显促进作用。OPG是属于肿瘤坏死因子受体超家族,在体内主要由成骨细胞和基质细胞合成,具有调节破骨细胞分化及活性的作用,可以直接影响破骨细胞的分化和功效,调节骨重建的横轴旁边的分泌系统,参与骨质吸收SERPINE1和股骨头的血管内紊乱有关,位于人类7号染色体的SERPINE1基因可编码PAI-1蛋白质,PAI-1由血小板和血管内皮在受到刺激并形成血栓时释放,主要作用于纤溶酶原激活物和尿酸酶纤溶酶原激活物,进一步发挥抑制纤溶酶原激活的作用,从而促进凝血,导致血栓或股骨头坏死。本研究将通过各种实验技术,对股骨头坏死病人的组织中的各类相关基因如BMP-2、PPAR-γ、OPG、HDAC9c-S、SERPINE1和股骨头坏死的相关性进行研究,进一步研究SERPINE1的基因多态性与股骨头坏死的关系,最后在人软骨细胞中明确OPG的过表达是否对软骨细胞的凋亡有保护作用。目的第一部分:分别检测正常组、激素性和酒精性股骨头坏死患者股骨头组织中的BMP-2、PPARγ、OPG、HDAC9c-S基因以及SERPINE1表达水平,探讨股骨头坏死发生是否和以上基因之间存在关系。第二部分:利用基因芯片对外周血中SERPINE1 rs11178和rs2227631多态性以及SERPINE1单倍体分析,研究其与股骨头坏死之间相关性。第三部分:以第一部分的研究结果为基础,在人软骨细胞中过表达OPG,检测其对tBHP诱导的人软骨细胞凋亡的作用。方法第一部分:收集2012年10月至2015年10月于我院就诊并经临床诊断和组织病理学检查确诊为激素性和酒精性股骨头坏死的住院治疗病人自愿捐赠的股骨头骨组织共106例作为研究对象,记录患者的性别、年龄、病程、ARCO分期等一系列临床特征。选取于我院就诊的股骨颈骨折且自愿捐赠股骨头骨组织的患者109例作为对照组。观察患者股骨头病理变化情况;qPCR技术相结合检测股骨头组织中的基因BMP-2、PPARγ、OPG、HDAC9c-S表达水平;使用western blot技术对组织中BMP-2、PPARγ、OPG、HDAC9c-S蛋白表达进行检测;第二部分:利用基因芯片多态性检测SERPINE1rs11178和rs2227631多态性分析,连锁不平衡等方法计算基因型的频率差异。第三部分:在人软骨细胞中应用慢病毒转染的方法使细胞中过表达OPG,在tBHP的氧化应激条件下,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测ROS和凋亡,TUNEL法检测凋亡,western blot检测细胞凋亡相关信号通路蛋白的表达。结果第一部分1.股骨头组织病理学观察结果:正常对照组患者股骨头组织形态饱满且圆润,关节软骨完整、表面平滑及色泽光白;激素型股骨头坏死患者股骨头组织形态扁平塌陷、关节软骨处有破裂、磨损,剖开后可见坏死区被无骨小梁结构的灰黄色颗粒状沙样坏死组织所充满;酒精性股骨头坏死患者股骨头组织剖开后可见坏死区大块坏死骨,有无骨小梁结构的灰黄色颗粒状沙样坏死组织,周围正常骨组织被灰褐色样带所分隔;HE染色发现,正常骨颜色均一光滑,死骨和激素性股骨头坏死组织有血细胞,并伴有炎性细胞浸润,相对于正常股骨头组织有明显差异。2.qPCR技术检测股骨头标本中的基因表达:和正常组相比,激素性股骨头坏死患者BMP-2表达水平显著下降(P<0.05),而酒精性股骨头坏死患者BMP-2表达水平与正常组、激素性股骨头坏死患者相比无显著差异(P>0.05)。和正常组相比,激素性和酒精性股骨头坏死患者PPARy表达水平均显著上升(均P<0.05);和激素性股骨头坏死患者相比,酒精性股骨头坏死患者PPARγ表达水平显著升高(均P<0.05)。和正常组相比,激素性和酒精性股骨头坏死患者OPG表达水平均显著下降(均P<0.05)。和正常组相比,激素性和酒精性股骨头坏死患者HDAC9c-S表达水平均显著上升(均P<0.05);和激素性股骨头坏死患者相比,酒精性股骨头坏死患者HDAC9c-S表达水平显著升高(P<0.05)。和正常组相比,激素性和酒精性股骨头坏死患者SERPINE1表达水平均显著上升(均 P<0.05)。3.Western Blot检测股骨头标本中的蛋白表达:和正常组相比较,激素性股骨头坏死组和酒精性股骨头坏死组中BMP-2以及OPG中表达出现明显下降(均P<0.05);和正常组相比较,酒精性股骨头坏死组和激素性股骨头组中HDAC9c-S蛋白表达出现明显下降(均P<0.05),同时和酒精性股骨头坏死组相比,激素性股骨头坏死组中出现明显下降(P<0.05);在PPARγ中,酒精性股骨头坏死组和激素性股骨头坏死组相比较正常组明显上升(均P<0.05),同时和酒精性股骨头坏死组相比,激素性股骨头坏死组明显上升(P<0.05)。正常组相比激素性坏死组和酒精性坏死组在SERPINE1蛋白表达中出现明显下降(均P<0.05)。第二部分1.通过观察rs11178基因型和等位基因频率在病例组和对照组之间不存在明显差异(P>0.05)。虽然rs2227631 AG基因型频率在病例组和对照组之间存在一定差异,但是差异并不明显。rs2227631 AA基因型频率明显增高,提示其和ANFH的发病之间显著相关(P=0.024,OR= 2.363,95%,CI=1.110-5.028)。rs2227631 上碱基A的突变和ANFH之间密切相关,其预示着ANFH的风险增加(P=0.016,OR=1.606,95%C1=1.090-2.367)。2.在rs11178和rs2227631位点上不存在连锁不平衡(D = 0.765,R2 = 0.506)。由两个单核苷酸多态性构成的四个单倍型。T-A和C-A单倍型在病例组发现比对照组更频繁。但相比T-G单倍型,T-A单倍型显著增加,对照组相比较股骨头坏死组具有显著差异(P=0.016,OR=2.271,95%CI= 1.154-4.469)。第三部分人软骨细胞中应用慢病毒转染方法过表达OPG,结果显示过表达OPG可以显著抑制氧化应激诱导因子tBHP诱导的人软骨细胞活性降低和ROS的升高,主要是通过OPG的过表达抑制人软骨细胞晚期凋亡和早期凋亡,TUNEL法也进一步证实此作用;通过对细胞凋亡相关信号通路蛋白表达检测发现OPG过表达的软骨细胞主要是通过促进Akt的磷酸化、促进Bcl-2的表达、抑制Caspas-3的剪切,并抑制Bax的升高表达发挥其抗凋亡和抗氧化应激作用。结论第一部分通过对比106例股骨头坏死的股骨头组织和109例正常股骨头组织的病人样本,发现相对于正常股骨头组织:BMP-2的表达下调、PPARγ的表达上调、OPG的表达下调、HDAC9c-S的表达上调、SERPINE1的表达上调有关;激素性股骨头坏死和酒精性股骨头坏死患者之间的PPARγγ和HDAC9c-S表达有显著差异,可能和两种类型疾病的发病机制有关,但仍需进一步研究。SERPINE1的表达上调和BMP-2、PPARγ、OPG以及HDAC9c-S之间可能存在相互调节作用,但机制尚需要进一步研究。第二部分SERPINE1基因rs2227631多态性与股骨头坏死相关,同时单体型rs11178与rs2227631与股骨头坏死相关;SERPINE1的表达上调和rs2227631多态性可能存在联系。第三部分在人软骨细胞过表达OPG,可以显著抑制氧化应激诱导因子tBHP诱导的细胞活性降低和ROS的升高,而此作用与其OPG的过表达抑制晚期凋亡和早期凋亡发挥作用,而TUNEL法也进一步证实这个结果。通过对细胞凋亡相关信号通路的研究,发现OPG过表达的软骨细胞主要是通过促进Akt的磷酸化、促进Bcl-2、抑制Caspas-3的剪切和Bax的表达发挥其抗凋亡和抗氧化应激作用。