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研究背景和研究目的:肝癌是我国最常见、死亡率较高的恶性肿瘤之一,其发病率有逐年升高及发病年龄提前的趋势。肝癌侵袭性强,术后复发快,死亡率高,未经治疗的生存期不超过10个月。近年来,尽管肝癌的临床研究取得了一定的进展,但与肝癌发生相关的分子机制仍远未阐明。研究发现,β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor,β-AR)被激活后可以促进肿瘤的新血管生成、迁移侵袭、上皮间质转化和炎症等许多恶性生物学行为,同时β-AR也可以调控与这些恶性生物学行为相关的多条信号通路。本项目主要研究激活β-AR后促进HepG2细胞增殖的相关信号机制。实验方法:1.肝癌细胞(HepG2)β1-AR、β2-AR基因表达的检测:从肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(LO2)中提取的总RNA,然后用qPCR或RT-PCR检测细胞的β1-AR、β2-AR的m RNA表达水平。2.去甲肾上腺素(NE)对HepG2细胞增殖的影响:用浓度分别为0、1、2、5、10、20、30μM的NE刺激HepG2细胞和LO2细胞48h后,用MTT法检测细胞的增殖情况。再用浓度为0、5、10和20μM的NE分别刺激HepG2细胞24h、48h、72h,用MTT法检测细胞的增殖情况。3.NE对细胞迁移及细胞形态的影响:分别用细胞划痕实验和EMT实验检测激活β-AR对HepG2细胞迁移和细胞形态的影响。4.NE促进HepG2细胞增殖的机制分析:1)β-AR的特异性抑制剂PRO或ERK1/2的特异性抑制剂U0126对NE诱导HepG2增殖的影响:上述抑制剂处理HepG2细胞30min,然后分别用NE刺激细胞48h,再用MTT法检测细胞的增殖情况;2)CREB特异性si RNA干扰CREB后,用NE刺激HepG2细胞48h,再用MTT法检测细胞的增殖情况;3)各种抑制剂对NE诱导下游信号通路的影响:首先用浓度为10μM的NE分别在0、2、5、10、20、30、60和120 min刺激HepG2细胞,western blot分别检测ERK1/2、CREB、AKT和PDK1的磷酸化情况,并观察各种抑制剂对NE介导的下游靶蛋白磷酸化的影响。实验结果:1.qPCR和RT-PCR结果显示,肝癌细胞(HepG2)β1-AR、β2-AR的m RNA表达水平明显高于LO2细胞。2.NE明显促进HepG2细胞的增殖,并呈浓度依赖性。NE的最佳浓度为10μM,最佳时间为48h。3.NE对HepG2的细胞迁移和细胞形态无明显影响。4.机制分析:1)β-AR的特异性抑制剂PRO、ERK1/2的特异性抑制剂U0126以及特异性干扰CREB后,均可明显抑制NE促HepG2细胞增殖效应;2)NE(10μM)可显著增加HepG2细胞的ERK1/2、CREB、AK T和PDK1的磷酸化水平;3)β-AR的特异性抑制剂PRO和ERK1/2特异性抑制剂U0126均可明显抑制NE刺激HepG2细胞诱导的ERK1/2和CREB的磷酸化作用。结论:1.肝癌细胞(HepG2)β1-AR和β2-AR的表达水平远高于正常肝细胞(LO2)。2.NE显著促进HepG2细胞的增殖,但对细胞迁移及细胞形态没有明显影响。3.NE促进HepG2细胞增殖的机制可能与其激活β-AR介导的ERK1/2/CREB信号通路以及PI3K/PDK1/AKT信号通路有关。