基于CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌

来源 :天津科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lujunjun_1204
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食源性致病菌存在于各种食物中,它们可以在生产、加工、分销和营销的各个阶段进入食品供应链。沙门氏菌是导致食源性致病菌的主要原因之一,所以在食物中对沙门氏菌进行检测是减少食源性疾病的发病率所必需的一项工作。近年来,实验室现有的检测方法已经非常成熟,但是它们都有各自的缺陷,如检测时间较长、使用不便等。因此,迫切需要研究一种快速、高灵敏、高特异的病原菌现场检测方法。本论文开发了两种基于CRISPR-Cas12a平台检测沙门氏菌的方法。其中一种方法是基于G四面体的CRISPR-Cas12a生物检测方法,用于超灵敏和高特异性的病原菌检测。与以往的细菌检测策略相比,基于G四面体的CRISPR-Cas12a生物检测法不仅充分利用了基于CRISPR-Cas12a的诊断的高灵敏度和高特异性,而且将目标识别转化为可视化的信号读数,拓宽了应用范围。结合基于G-四面体DNAzyme的比色反应,检测结果可以通过肉眼和装有颜色识别器APP的智能手机直接可视化和区分。本文中提出的生物测定的性能非常出色,并在3 h内完成检测。其最低的检测限值为1CFU/m L,检测范围为10~0到10~8 CFU/m L,并且有良好的线性关系,R~2=0.993。该生物检测方法操作简单避免了对复杂仪器和专用检测器的依赖,而且已成功应用于各种食品样品中沙门氏菌的检测,如啤酒、果汁等。另一种检测方法是叠氮溴化丙锭(PMA)和CRISPR-Cas12a系统联合使用的用于活的病原菌的检测。该方法不仅利用了CRISPR-Cas12a的高灵敏度和特异性;更重要的是,它结合了新型的核酸染料PMA和阴离子洗涤剂N-月桂酰基肌氨酸钠。它能够有效抑制死细菌中基因组DNA的扩增,消除检测过程中死菌产生的信号干扰。PMA与Cas12a系统联用检测活细菌的方法能定量检测到0.1%的活细菌,同时适用于啤酒和果汁中存活的沙门氏菌。本论文构建的基于CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的平台具有高灵敏度、特异性和现场检测能力。这不仅扩大了CRISPR-Cas生物传感技术的应用范围,而且可作为食品安全评估的有效工具。
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