9-羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮（9-OH-AD）作为重要的甾药前体物质,可以合成多种甾体药物,在甾药行业中占重要地位。在生产9-OH-AD的过程中,偶发分枝杆菌先将植物甾醇代谢为丙酰辅酶A和乙酰辅酶A,会造成胞内丙酰辅酶A含量瞬间增多,影响菌株的生长和转化。目前大多数研究都集中在分枝杆菌中已报道的三条内源代谢途径上,而外源引入丙酰辅酶A代谢途径能否调控丙酰辅酶A代谢,以及其对植物甾醇转化的影响等还不明晰。因此本文以9-OH-AD的主要生产菌株偶发分枝杆菌为研究对象,基于本课题组前期辅因子调控的工作的基础,结合基因工程、代谢工程等经典方法和辅因子调控的整体调控策略,引入一条新的外源丙酰辅酶A代谢途径,解除胞内丙酰辅酶A含量过高对工程菌株产物产率的影响,为9-OH-AD的高效生产提供稳定优良的菌株,同时也为其他植物甾醇转化工程菌株的构建提供新策略。首先本文研究了来源大肠杆菌BL21的丙酰辅酶A:琥珀酸辅酶A转移酶（scp C）对偶发分枝杆菌转化反应的影响,构建了过表达菌株MFT-scp C,并对该菌株的生长性能、9-OH-AD转化率及胞内丙酰辅酶A含量进行检测,结果表明胞内过量的丙酰辅酶A转变成琥珀酸辅酶A,解除了对菌株的毒害作用,提高了细胞活力,进而提高了9-OH-AD转化率;其次研究了II型NADH脱氢酶（ndh）和9-羟化酶（ksh）对植物甾醇转化反应的影响,构建了串联表达菌株MFT-scp C-ndh、MFT-scp C-ndh-ksh,并对菌株的转化效率、胞内NAD+、NADH含量及ATP含量进行了检测,结果表明改造菌MFT-scp C-ndh一定程度上解决了植物甾醇侧链降解过程中胞内辅因子不平衡的问题,提高了NAD+/NADH比率及ATP含量,维持了胞内辅因子动态平衡,降低了甾醇转化的抑制作用,此时发酵84 h转化率为66.4%,而菌株MFT-scp C-ndh-ksh与MFT-scp C-ndh的转化率仅相差1.6%;然后研究了乳酸杆菌中琥珀酸辅酶A转移酶（Aar C）,构建了三基因串联表达菌株MFT-scp C-ndh-Aar C,将所有菌株进行发酵转化,结果表明MFT-scp C-ndh-Aar C可以将代谢过程中大量积累的琥珀酸辅酶A转化为乙酰辅酶A后进入TCA循环,提高了9-OH-AD的转化率,该菌在发酵84 h时植物甾醇的转化率可达到76.7%,比原始菌提高了13.6%。对三基因串联表达菌株的底物浓度、发酵液p H值、底物与环糊精比例以及底物投放时间等发酵条件进行了优化。结果表明在发酵24 h时投加底物浓度为7 g/L底物,底物与环糊精最适比例为1:2,最佳发酵液p H值为7.5时进行摇瓶发酵实验,最终重组菌MFT-scp C-Aar C-ndh 9-OH-AD的摩尔转化率达到了87.2%,比优化前提高了10.5%,比原始菌底物浓度5 g/L时的转化率提高了37%。