目的:Mediator complex(MED复合物)是一种多亚基的复合物,通过与转录因子之间的特定相互作用控制着广泛的生理功能,包括增殖、分化和肿瘤发生。MED23作为MED复合物的亚基之一,以往的研究结果发现MED23参与食道鳞状细胞癌和肺癌的发生。多种肿瘤细胞中均有自噬活性的改变,肿瘤的自噬活性由肿瘤的类型、微环境、特定基因以及信号通路共同决定。目前,在肿瘤中关于MED23的分子调节机制的研究还少有报道,而且MED23在肿瘤中是否参与自噬的调控还未有报道。因此本项研究的目的是在肺癌中探究MED23参与细胞自噬调控途径诱导细胞发生早熟性衰亡的分子机制以及其临床应用价值。此项研究将丰富人们对肺癌中自噬调控机制的认识,希望能为临床治疗提供新的理论依据。方法:本研究由三部分组成。第一部分:MED23在肺癌的表达以及对肿瘤自噬的影响。利用肺癌组织芯片,通过免疫组织化学染色来分析MED23在肺癌组织之间的表达规律以及与患者生存期之间的关系。利用蛋白免疫印迹实验在肿瘤细胞系中验证MED23的差异性表达。利用慢病毒介导的sh RNA来下调MED23的表达,通过Western blot实验检测自噬相关标记蛋白SQSTM1和LC3B-II的变化,同时利用自噬抑制剂Baf A1或自噬激活剂Torin处理细胞来再次确定MED23所引起的自噬相关标记蛋白的改变。利用转染质粒GFP-LC3-RFP-LC3ΔG实验监控肺癌细胞下调MED23后所引起的自噬流的改变,然后通过β-gal实验检测下调MED23之后肺癌细胞所产生的生物学功能变化。第二部分:MED23干预自噬途径诱导肺癌细胞发生早熟性衰亡的机制。在肺癌细胞系A549中稳定过表达带有Flag标签的MED23,经免疫沉淀质谱鉴定分析MED23的相互作用蛋白BCLAF1。通过Co-IP和Duolink方法验证BCLAF1与MED23之间的相互作用。利用慢病毒介导的sh RNA下调BCLAF1后检测自噬流的变化。结合β-gal实验检测下调BCLAF1之后肺癌细胞所产生的生物学功能变化。第三部分:提取肺癌细胞系A549shcon和稳定下调BCLAF1的细胞系A549sh BCLAF1的总RNA,进行转录组测序,利用生物信息学分析寻找差异表达的基因以及BCLAF1潜在的下游基因。通过Ch IP和Luciferase实验来证实NUPR1是转录因子BCLAF1的靶基因。将AAV介导的NUPR1 sh RNA病毒和Trifluoperazine(TFP)联合应用,观察裸鼠体内肿瘤的发展变化,以此来证明AAV介导的NUPR1下调与TFP联合使用能够削弱肺癌细胞体内的增殖能力。结果:第一部分研究结果显示:在人肺癌组织芯片中的IHC结果表明与正常的癌旁组织相比,MED23在肺癌患者的癌组织中表达显著增高,而且MED23表达水平低的肺癌患者比表达水平高的患者具有更长的生存期。MED23在多种肿瘤细胞系中的表达具有显著的差异性。Western blot实验检测下调MED23的肺癌细胞中自噬的标记蛋白结果表明自噬被抑制。监测细胞自噬流量变化的GFP-LC3-RFP-LC3ΔG实验进一步确认了此实验结论。β半乳糖苷酶染色实验结果显示下调MED23的肺癌细胞出现早熟性衰亡。第二部分研究结果显示:在肺癌细胞系A549中稳定过表达带有Flag标签的MED23,质谱鉴定、PLA实验和免疫共沉淀实验结果发现MED23结合转录因子BCLAF1。在肺癌中通过慢病毒介导的sh RNA下调BCLAF1导致肺癌细胞中的自噬流量减少,自噬被抑制。同时结合β-gal实验检测肺癌细胞所产生的生物学功能变化,发现BCLAF1下调能够诱导肺癌细胞发生早熟性衰亡现象,与下调MED23相似。第三部分研究结果显示:RNA-seq测序分析发现与对照组细胞相比下调BCLAF1的A549细胞中自噬溶酶体相关途径的许多基因表达有显著差异。通过RT-PCR实验、Ch IP实验和荧光素酶报告基因检测实验发现NUPR1是BCLAF1的靶基因。通过AAV介导的NUPR1 sh RNA病毒和TFP联合应用,观察裸鼠体内肿瘤的发展变化,发现AAV介导的NUPR1下调与TFP联合应用削弱裸鼠体内肺癌细胞的增殖。