甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)自被发现以来，作为一个胎儿异常和肿瘤的标志物，在临床诊断和病情监测等方面发挥了重要作用，其在临床中的意义受到人们的充分研究。然而甲胎蛋白的生理学功能及其在肿瘤发生发展中的生物学作用受到的关注却相对较少，只是在最近十年中人们才意识到甲胎蛋白在肿瘤生长中的调节作用并开始实验研究。甲胎蛋白阳性胃癌(alpha-fetoprotein-producing gastric carcinoma，APGC)是一种特殊类型的胃癌，特征是AFP升高和及肿瘤组织表达AFP升高，其临床病理学特征与普通型胃癌有较大不同，更易发生肝转移和早期淋巴道转移，具有明显的侵袭性和恶性生物学行为，发病率约占胃癌的5.1％-15％。由于APGC患者就诊时多有转移，常不能手术根治切除，切除后也易复发，故寻找新的治疗药物和治疗手段乃当务之急。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术，是一种双链RNA(dpubic-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程。目前，在某些病毒性疾病的治疗研究中己取得了一定的进展，在基因功能研究和基因治疗方面也己显示了巨大的应用前景。 鉴于体外合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)费用高，持续作用不能保证，我们首先在体外构建了能在细胞内表达发夹状shRNA的载体，再将载体转染入细胞内，在FU97细胞内转录出siRNA从而引发基因沉默，观察其对FU97细胞AFP基因表达的抑制作用及其对细胞生长抑制及凋亡诱导作用。 目的： 本研究旨在利用RNAi技术，构建能在细胞内表达AFP shRNA的pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector，通过体外试验探讨AFP特异性siRNA抑制甲胎蛋白阳性胃癌细胞株FU97的AFP基因表达并抑制肿瘤细胞的生长以及其作用机理，以期为其治疗提供一个新的特异性基因治疗手段，同时为获得AFP基因的最佳siRNA序列和RNAi应用于临床胃癌提供实验基础。 方法： (1)选择3个符合条件的AFP特异性RNA干涉靶序列，分别体外合成两段互补的寡核苷酸，与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector连接； 确定构建成功后，转染入FU97细胞中。 (2)用脂质体/质粒载体不同剂量及浓度配比转染FU97细胞，荧光显微镜观察转染效率，并检测细胞培养上清液AFP的量的变化，筛选出最佳阳离子脂质体/质粒载体配比。 (3)在质粒转染入肿瘤细胞48小时后，用Real-time PCR法检测AFP基因在mRNA水平的变化，免疫细胞化学法、化学发光免疫分析仪、western blot检测AFP蛋白表达变化。筛选出AFP基因的最佳siRNA序列。 (4)用筛选出的AFP siRNA转染FU97细胞，MTT实验、DNAladder检测抑制AFP基因后对FU97细胞生长抑制、诱导凋亡作用。 (5) 流式细胞术及ELISA检测抑制AFP基因后对FU97细胞VEGF蛋白表达变化。 结果： (1)基因测序结果表明插入片段的序列与合成的AFP寡核苷酸序列完全相符，即成功构建siRNA表达载体。 (2)筛选出最佳的阳离子脂质体/质粒载体转染复合物的配比为8μl：2μg。 (3)Real-time PCR结果表明在mRNA水平，所构建的三个质粒都可抑制AFP基因的表达；培养上清的结果进行统计学分析显示实验组三组与空白对照组之间的AFP水平均不同(P<0.05)；免疫细胞化学法、western blot结果显示所构建的质粒均可抑制AFP蛋白水平的表达。与空白对照相比，pDonor Vector-A1和pDonor Vector-A3抑制效果较明显，而pDonor Vector-A2的抑制效果最差。 (4)MTT实验表明抑制了AFP基因表达后能够明显抑制FU197的生长；DNAladder检测显现明显的梯状图谱。 (5)流式细胞术及ELISA检测结果证实抑制AFP基因后可降低FU97细胞VEGF蛋白的表达。 结论： RNA干扰技术能有效地抑制FU97细胞AFP基因表达，并可抑制细胞生长诱导凋亡，同时通过下调VEGF表达抑制肿瘤血管生成。这种方法不仅对体外研究AFP基因功能有一定意义，而且为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗提供了依据。