研究背景 原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHCC）因起病较隐匿，生长迅速，恶性程度高，待发现时常已生长较大或出现远处转移征象。根据卫生部统计，我国肝癌死亡率在各种癌症中居第2位，成为严重危害人类生命健康的重大疾病之一。在肝癌治疗所有手段中，虽然肝切除术和肝移植仍然是肝癌患者治疗的主要方法，但由于PHCC的生物学特征，即富血管性、多中心性起源及肿瘤多发性的生物学特征，早期即可侵犯门静脉、发生肝内转移。部分患者常合并有肝硬化，多为中晚期，使外科的手术风险明显增大，术后病灶的残留或手术本身的创伤导致术后复发率高，限制其治疗上的进一步突破。 近年来，在肝癌的早期诊断、外科治疗以及综合治疗等方面都取得了显著进步，在一定程度上改善了现有肝癌的治疗效果，提高了患者的总体生存率。特别是肝癌的介入微创治疗的模式如经皮肝动脉化疗栓塞（Transcatheter arterial chemo-embolization，TACE）、碘油化疗药乳剂局部注射（Chemotherapic agents lipiodol emulsion，CALE）、和经皮穿刺消融等微创治疗，以及分子靶向和生物基因疗法等，已得到广泛的应用，并取得了不错的疗效，但依然面临着种种困境。因此，如何能进一步提高肝癌的综合治疗效果，人们在不断地探索新的治疗模式，而肝癌基础研究方面的进展为肝癌的治疗提供了新的希望。 目前，对自由基的绝大多数研究仍聚焦在其危害性的一面，探讨如何使用自由基清除剂来抑制疾病的发生发展。相反，对如何合理利用自由基来抗肿瘤的研究较少。本实验拟采用黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应体系产生氧自由基，并制作动物肝癌模型，通过介入途径，分三部分观察各种成分对杀伤肿瘤细胞效能，分析其可能的作用机制，并探讨其治疗的安全性，为肝癌治疗的动物实验提供进一步的理论基础和依据。 目的： 评价采用黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应体系产生氧自由基，并制作兔VX2移植性肝癌模型，通过介入途径来治疗实验性瘤兔的疗效，同时阐述其治疗机制及其安全性。 材料与方法: 第一部分：兔VX2移植性肝癌模型的建立及肝动脉内置管 第二部分：黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应体系治疗兔VX2移植性肝癌的疗效和机制研究 第三部分：黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应体系治疗兔VX2肝癌的安全性评价实验分组：（共6组） 组1：肝动脉导管灌注黄嘌呤氧化酶（30u），同时静脉内输注次黄嘌呤（1.0mM），共30min；（XO+HX组） 组2：肝动脉导管灌注黄嘌呤氧化酶（30u），静脉输注生理盐水（10ml），30min；（XO+NS组） 组3：肝动脉导管内灌注生理盐水（10ml），静脉输注次黄嘌呤（1.0mM），30min；（HX+NS组） 组4：先静脉注射DDC3.0×10-2 mmol/L-1，肝动脉导管灌注黄嘌呤氧化酶（30u），同时静脉内输注次黄嘌呤（1.0mM）；（DDC组） 组5：先静脉输注CuZnSOD10，000u/kg，肝动脉导管灌注黄嘌呤氧化酶（30u），同时静脉内输注次黄嘌呤（1.0mM）；（SOD组） 组6：肝动脉导管内灌注生理盐水（10ml），静脉输注生理盐水（10ml），30min。（NS组） 疗效评价： （1）明确肿瘤存活，观察肿瘤的生长状况，对各组实验兔行US、MRI检查，检测治疗后肿瘤增长体积、肿瘤增长率及肿瘤坏死率。 （2）组织病理学的改变：大体观察，常规HE染色及光镜下观察。 （3）免疫组织化学检测：采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法（SP法）检测治疗后肿瘤组织P53和Bcl-2表达阳性率的差异。 （4）肿瘤组织细胞原位凋亡：TUNEL法测定治疗后肿瘤组织中凋亡细胞比例。 （5）Q-RT-PCR分析肿瘤组织中P53和Bcl-2 mRNA相对含量。 （6）安全性监测外周血检测血常规，肝、肾功能。 （7）统计学分析。应用SPSS13.0统计软件，所有数据采用X±S（均值±标准差）方式表示。组间多重比较用One-Way ANOVA分析；治疗前、后外周血指标比较采用配对T检验；P<0.05为有统计学意义。 结果: （1）兔VX2肝移植癌模型成功制作，肝动脉内顺利置管。 （2）HX和XO联合应用可致移植癌兔中TBARS含量显著上升，DDC可显著增强HX与XO产生TBARS的能力；SOD可减弱HX与XO产生TBARS能力。 （3）肿瘤增长体积在治疗前各组间无显著差异；治疗后7天DDC组肿瘤生长率显著低于XO+HX组（P=0.032），XO+HX组显著低于SOD组（P=0.020），SOD组显著低于NS组（P=0.001）。治疗后7天NS组、HX+NS组和XO+NS组中未发现明显肿瘤坏死，其余三组中出现肿瘤坏死。各组坏死率之间有统计学差异（F=24.57，P=0.001），DDC组肿瘤坏死率显著高于XO+HX组（P=0.004）和SOD组（P=0.000），XO+HX组显著高于SOD组（P=0.048）。 （4）常规组织病理学变化：DDC组见大片状坏死，切面中心可见坏死、液化区形成。XO+HX组肿瘤切面中央可见大片状的凝固坏死。SOD组肿瘤局部充血、肿胀，间有片状出血灶及坏死。XO+NS组、HX+NS组中可见大量炎性细胞浸润。 （5）免疫组织化学检测： ①P53免疫组化显示各组间有显著差异（F=50.69，P=0.000），其中XO+NS组、HX+NS组和NS组之间无统计学差异（P>0.05）。其余，DDC组肿瘤组织中P53表达阳性率显著高于XO+HX组（P=0.000），XO+HX组显著高于SOD组（P=0.019），SOD组显著高于NS组（P=0.002）。 ②Bcl-2免疫组化显示各组间有显著差异（F=10.29，P=0.001），其中XO+NS组、HX+NS组和NS组之间无统计学差异（P>0.05），DDC组、SOD组与XO+HX组之间无显著差异（P>0.05）。DDC组Bcl-2表达显著低于NS组（P=0.000），SOD组显著低于NS（P=0.028），XO+HX组显著低于NS组（P=0.002）。 （6）TUNEL法测定治疗后各组肿瘤组织中凋亡细胞比例显示：镜下见大片细胞凋亡。肝癌细胞均出现凋亡表现：细胞体积明显缩小，核呈蓝紫色，断裂为多个碎块状；凋亡细胞核呈棕色，显示细胞核内有原位断端修复酶表达。统计分析显示各组间有显著差异（F=32.29，P=0.000），其中XO+NS组、HX+NS组和NS组之间无统计学差异（P>0.05）。其余，DDC组肿瘤组织中凋亡细胞阳性率显著高于XO+HX组（P=0.034），XO+HX组显著高于SOD组（P=0.031），SOD组显著高于NS组（P=0.003）。 （7）Q-RT-PCR分析肿瘤组织中P53和Bcl-2 mRNA相对含量：统计分析显示P53在各组间表达有统计学差异（F=19.15，P=0.000），其中XO+NS组、HX+NS组和NS组之间无统计学差异（P>0.05）。其余，DDC组P53 mRNA相对含量显著高于XO+HX组（P=0.032），XO+HX组显著高于SOD组（P=0.035），SOD组显著高于NS组（P=0.015）。Bcl-2 mRNA相对含量经统计分析显示，各组间有显著差异（F=24.78，P=0.000）。其余，DDC组Bcl-2mRNA相对含量显著高于XO+HX组（P=0.001），XO+HX组显著高于SOD组（P=0.039），SOD组显著高于NS组（P=0.000）。 （8）安全性监测提示：在DDC组治疗前、后7d，外周血示全血细胞计数、肝功、肾功各项指标无显著性差异（P>0.05）。常规病理检查治疗组瘤兔的心、肾等脏器未见明显异常变化。 结论: 1.采用超声引导下经皮穿刺针种植兔VX2肝癌模型，成瘤时间短，成功率高，实验周期短，模型制作便捷易行。 2.黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应，可致兔VX2肝癌内TBARS含量显著升高。联合DDC可使TBARS含量在原有基础上显著增加，SOD可显著抑制黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤产生TBARS的作用；单药黄嘌呤氧化酶和单药次黄嘌呤也可增加移植瘤内TBARS含量。 3.黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应，可显著抑制兔VX2肝癌的生长。联合DDC可显著抑制移植癌生长，联合SOD可显著削弱其抑制作用；单药黄嘌呤氧化酶和单药次黄嘌呤对肿瘤的生长无显著影响。导致肿瘤坏死的趋势亦符合上述规律。 4.黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应体系可诱导兔VX2肝癌细胞凋亡，治疗后可致移植癌内凋亡细胞比例显著增高，P53表达显著增强，而Bcl-2表达显著减弱。联合DDC可显著增强以上作用，联合SOD可显著降低上述作用；单药黄嘌呤氧化酶和单药次黄嘌呤则无上述作用。 5.黄嘌呤氧化酶与次黄嘌呤反应体系联合DDC是一种相对安全、有效的杀伤VX2移植癌的新方法。经肝动脉和股静脉联合给药为其治疗提供了较理想的给药方法及途径。