菜青虫（Pieris rapae）属鳞翅目粉蝶科,嗜食十字花科的白菜、甘蓝、油菜、萝卜、花椰菜等蔬菜,是危害严重的农业害虫之一。中肠作为昆虫消化器官的主要部位,能分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多种消化酶参与消化食物,而营养物质吸收是机体进行其他生命活动的基础。因此,若我们了解菜青虫食物消化机制,找到其中的关键消化酶,就能通过阻断其物质吸收来控制虫害。本文利用高通量测序技术、分子生物学等方法研究菜青虫受饥饿胁迫时转录谱变化,并挖掘消化相关基因;同时选取2个丝氨酸蛋白酶候选基因进行克隆、组织表达和异源表达研究。这些研究为进一步探索菜青虫食物消化吸收机制和可能抗虫靶点提供理论基础。主要结果如下:1.对菜青虫正常和饥饿两种状态中肠样本进行转录组测序,共获得的17.82Gb的数据,51544条Unigene。经NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KOG和KEGG数据库同源注释发现,共有22233条Unigene获得注释信息。对比两个转录组,共获得2682个差异表达基因,其中有1610个基因下调,1072个基因上调,有56个是高表达的差异表达基因。将差异表达基因经NR、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam和Swiss-Prot数据库功能注释发现,在菜青虫受到饥饿胁迫时,其物质代谢活动、能量代谢活动、酶合成及信号转导等受到明显影响。2.基于中肠作为菜青虫食物消化的主要场所,选择对其表达的消化相关基因进行挖掘,结果发现菜青虫中肠中表达了80个丝氨酸蛋白酶,10个淀粉酶,42个脂肪酶,34个羧肽酶,未发现纤维素酶,其食物中纤维素可能依靠菜青虫肠道菌进行消化。其中,在菜青虫受到饥饿胁迫时,差异表达的淀粉酶和羧肽酶全部下调,而丝氨酸蛋白酶和脂肪酶大部分下调,少部分上调,可能是为了减小体内的能量消耗且保持机体基本活动,对食物消化相关基因进行了调控。3.对菜青虫中肠转录组密码子使用偏好性进行分析,为后续研究提供理论基础。结果发现,菜青虫中肠密码子使用整体偏好性程度不高,但不同基因之间存在明显密码子使用偏好性;菜青虫中肠表达基因偏好以A/U结尾的密码子,GAA,UUU,AAU,UAU 4个密码子为其最优密码子;菜青虫中肠表达的丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶）在6种不同宿主中表达难度从大到小分别为:大肠杆菌B>昆虫High5细胞/哺乳动物HEK293S细胞>烟草/毕赤酵母/拟南芥。4.克隆了一个胰凝乳蛋白酶基因PrCT1,该基因编码区由861核苷酸组成,编码286个氨基酸,含有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体(H₅₇,D₁₀₂与S₁₉₅),经丝氨酸蛋白酶底物特异性口袋的分析显示属于胰凝乳蛋白酶。它与黑脉金斑蝶（GenBank登录号:OWR53227）胰凝乳蛋白酶的同源性最高,达到49%,且亲缘关系最近。利用qRT-PCR检测PrCT1基因在菜青虫中转录发现,它主要在菜青虫中肠表达,且饥饿与决明胰蛋白酶抑制剂喂食处理后表达水平均下调,推测其可能是菜青虫中肠中发挥食物消化作用的重要蛋白酶,且可能是重要的抗虫靶点。将PrCT1基因插入到原核表达载体pET28a,转化Rosseta（DE3）进行原核表达发现,PrCT1重组蛋白以包涵体形式表达;将PrCT1基因插入到真核表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母进行真核表达发现,PrCT1基因能在毕赤酵母中转录,但仅在胞内检测到非常低的目的蛋白表达。5.克隆了一个胰蛋白酶基因PrT1,该基因编码区由1206核苷酸组成,编码401个氨基酸,含有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体(H₅₇,D₁₀₂与S₁₉₅),经丝氨酸蛋白酶底物特异性口袋的分析显示属于胰蛋白酶。它与脐橙螟（GenBank登录号:XP₀13191840）和蜡螟（GenBank登录号:AXY94763）丝氨酸蛋白酶同源性最高,分别为61.32%、59.19%,且亲缘关系最近。将PrT1基因插入到原核表达载体pET28a,转化Rosseta（DE3）进行原核表达发现,PrT1重组蛋白也以包涵体形式表达。再将PrT1重组蛋白皮下注射新西兰兔制备多克隆抗体,经Western Blot检测抗体特异性较好。利用qRT-PCR和Western Blot检测PrT1在菜青虫不同组织部位表达发现,qRT-PCR和Western Blot检测结果基本一致,PrT1主要在菜青虫中肠表达,其他部位（头、尾、脂肪体）表达量非常低,同时在菜青虫受到饥饿胁迫时,PrT1在菜青虫中肠表达水平显著升高。因此,我们推测胰蛋白酶PrT1可能在菜青虫中肠参与食物消化,但其具体功能还需后续进一步研究才能了解。