【摘 要】
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第一部分耐利妥昔单抗弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株建立和特征分析目的 弥漫大B细胞淋巴瘤患者发生耐药及复发是治疗失败的主要原因,故诱导人弥漫大B细胞淋巴瘤耐利妥昔单抗的耐药细胞株,为寻找与耐药相关的靶分子和探索克服耐药的研究奠定基础。方法 本部分研究采用利妥昔单抗大剂量间断冲击结合梯度递增药物浓度的方法培养建立人弥漫大B细胞淋巴瘤耐利妥昔单抗的耐药细胞株（SU-DHL-6-R和NU-DUL-1-R）。采
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第一部分耐利妥昔单抗弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株建立和特征分析目的 弥漫大B细胞淋巴瘤患者发生耐药及复发是治疗失败的主要原因,故诱导人弥漫大B细胞淋巴瘤耐利妥昔单抗的耐药细胞株,为寻找与耐药相关的靶分子和探索克服耐药的研究奠定基础。方法 本部分研究采用利妥昔单抗大剂量间断冲击结合梯度递增药物浓度的方法培养建立人弥漫大B细胞淋巴瘤耐利妥昔单抗的耐药细胞株（SU-DHL-6-R和NU-DUL-1-R）。采用7AAD流式染色检测利妥昔单抗对耐药株和亲本株的补体依赖的细胞毒性效应;CFSE/7AAD/Annexin V流式染色检测利妥昔单抗对耐药株和亲本株的抗体依赖的细胞毒性效应,并检测亲本株和耐药株的生长曲线,细胞周期和细胞表面抗原表达;对人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株NU-DUL-1和耐利妥昔单抗的NU-DUL-1-R进行转录组和850K甲基化芯片测序。结果 建立人弥漫大B细胞淋巴瘤耐利妥昔单抗的耐药细胞株NU-DUL-1-R和SU-DHL-6-R,与亲本株相比利妥昔单抗对耐药株的补体依赖的细胞毒性效应显著降低,利妥昔单抗对NU-DUL-1-R的抗体依赖的细胞毒性效应也显著降低;与亲本株相比,耐药株对数生长期的细胞增殖速度变慢;采用流式细胞术对两株耐药株与其亲本株的细胞周期进行分析,其各个细胞周期比例、增殖指数差异无统计学意义（P>0.05）,但耐药株增殖指数有变小的趋势;CD20在两株耐药细胞株中均低表达,相较于SU-DHL-6,SU-DHL-6-R的CD55、CD59等补体调节蛋白表达明显升高（P0.05）。筛选出NU-DUL-1和NU-DUL-1-R差异表达基因289个,相较于NU-DUL-1,NU-DUL-1-R中表达上调的126个,表达下调的163;筛选出11656个差异甲基化位点,对应的具有显著甲基化差异的基因共4880个基因;758个差异甲基化区域,对应的具有显著甲基化差异的基因共738个基因;差异甲基化位点对应的基因与转录组差异基因联合分析得到8个基因在DNA甲基化程度和RNA转录水平均有差异。相较于NU-DUL-1,TINAGL1在NU-DUL-1-R中是低甲基化高表达,FCRL5和RASGRP3（TSS上游1989bp）是低甲基化低表达,PLD4、MS4A7、PREX1、RASGRP3（TSS上游56bp）、ADAM28、RINL是高甲基化低表达。结论 成功建立人弥漫大B细胞淋巴瘤耐利妥昔单抗耐药细胞株并分析了其特征,并发现耐药株和亲本株之间PLD4、MS4A7、FCRL5、PREX1、RASGRP3、ADAM28、RINL、TINAGL1这8个基因在转录组水平和DNA甲基化水平均有差异,可能与利妥昔单抗耐药有关。第二部分地西他滨联合利妥昔单抗增强对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株的杀伤目的 R-CHOP方案联合小分子药物以克服耐药是目前研究热点,初步临床试验发现,去甲基化药物对于复发/难治的弥漫大B细胞淋巴瘤患者有改善疗效作用。故探索DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨是否增加弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株对利妥昔单抗的敏感性并初步探索其机制,为地西他滨联合抗CD20单抗的免疫化疗提供新的理论依据。方法 以20%新鲜正常人血清为补体来源,死活染料7AAD流式染色检测地西他滨联合利妥昔单抗补体依赖的细胞毒性效应对肿瘤细胞的杀伤效果;CFSE标记肿瘤细胞后建立外周血单个核细胞与肿瘤细胞共培养体系,7AAD和PE-Annexin V流式染色检测地西他滨联合利妥昔单抗抗体依赖的细胞毒性效应对肿瘤细胞的杀伤,验证其是否可增加利妥昔单抗的敏感性;采用流式检测地西他滨对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株CD20表达的影响;流式检测地西他滨对外周血单个核细胞与肿瘤细胞共培养体系中Treg/Th17的影响;q PCR检测地西他滨对RORC、IL17和Foxp3 m RNA的影响;流式检测地西他滨和利妥昔单抗联用对外周血单个核细胞与肿瘤细胞共培养体系中Th17细胞的影响并收集细胞上清Elisa检测其对相关细胞因子的影响。结果 利妥昔单抗发挥补体依赖的细胞毒性效应时,联用组对NU-DUL-1-R、SU-DHL-6和SU-DHL-6-R的杀伤比单药组更强（P0.05）。流式检测出地西他滨上调了弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株表面CD20表达。结论 地西他滨联合利妥昔单抗对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株杀伤作用增强。可能机制是地西他滨上调弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株表面CD20,逆转利妥昔单抗作用后Th17比例的增加和IL17的分泌。
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