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研究背景急性或化脓性感染、中毒、恶性肿瘤、组织损伤等病理生理过程,均与嗜中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMNs)的定向迁移有关,而中性粒细胞的定向迁移与其极性和趋化性关系密切。中性粒细胞能够感知前后端不超过2%的趋化物浓度差异,进而通过信号放大效应在细胞内部激活大量的信号分子,引起蛋白和细胞器的重新分布,特别是F-actin和Myosin等细胞骨架的重构。最终导致细胞形状的变化,形成头部宽钝的片足和尾部窄长的尾足,即为中性粒细胞的极性化。正是在此基础上,通过片足的不断前伸和尾足与基质的不断黏连和解离,中性粒细胞能够穿越血管壁,向感染位置迁移和募集,即为细胞的趋化效应。常见的趋化物有来自细菌的多肽甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(fMLP)、白细胞介素8(IL-8)和补体成分c5a等,其中fMLP作用最强。Akt是分子量大约为60kD的丝/苏氨酸蛋白激酶,约由480个氨基酸残基组成,结构上分为N端(PH结构域)、中心催化结构域和C端(与PK调节区类似的区域)。Akt具有三种异构体：Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ和Akt3/PKBγ。磷酸化是Akt激活的主要机制,其调节主要依赖于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-Akt-磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)信号通路。Akt有两个磷酸化位点,分别位于催化域和调节域,即Thr308和Ser473,其完全激活需要两个位点都被磷酸化。小G蛋白,因分子量只有20～30KD而得名,由于具有GTP酶活性,能在多种细胞反应中充当开关的作用。小G蛋白的共同特点是,当结合了GTP后即成为可活化下游分子的活化状态,而当GTP被其自身水解为GDP时则恢复到非活化状态。我们实验涉及的小G蛋白主要是Rho家族,包括Racl、Rac2、Cdc42和rhoA等。其在细胞骨架网络的构成过程中发挥着调节作用,能调节胞浆中微丝肌动蛋白的聚合或解聚,从而影响细胞形态。已知,PI3K/Akt是中性粒细胞极性化过程中F-actin等聚合和解聚推动片足和尾足形成所谓正反馈环的基础,通过PI2k/Akt和Rho家族的小G蛋白的相互加强作用,形成朝向趋化物高浓度的前后极细胞轴。PI3K/Akt还可通过抑制包括Bad等凋亡基因的产生,进而在细胞凋亡的发生与调控过程中发挥重要的生物学功能。多数肿瘤都伴随有Akt丰度的增高,持续的Akt磷酸化活性增高与人类肿瘤发生、生长、迁移、浸润关系密切,也是化疗药物疗效不佳的一个重要原因。曲西立滨(Triciribine, TCN)是DNA合成抑制剂,能抑制Akt活性,具有广谱抗肿瘤细胞增殖作用。目前已有文献证实,在急性髓性白血病治疗,TCN已经进入到Ⅰ/Ⅱ期的临床研究,但TCN对从早幼粒白血病细胞(HL-60)诱导分化成的类中性粒细胞(dHL-60)极性化和凋亡的影响及机制,目前仍缺乏相关研究支持。目的本研究旨在先后通过不同浓度TCN和均匀浓度的fMLP分别处理dHL-60细胞,观察不同浓度TCN作用于Akt/Rho GTPases通路对dHL-60细胞极性化的抑制作用；并通过流式细胞技术、Western blot和GST pull-down等方法,分别检测不同浓度TCN对dHL-60的细胞凋亡以及Akt和小G蛋白活性的影响。方法1.复苏后经传2代的HL-60细胞,培养到细胞对数生长期,收集1.5×105个HL-60细胞置于15ml含1.25%DMSO的诱导分化液中,在37℃、含5%CO2的孵育箱进行培养诱导分化4d,进行下一步的实验。2.用Zigmond小室建立fMLP浓度梯度为0-100nM,在此浓度梯度下,观察不同浓度TCN预处理dHL-60细胞所引起的定向极性化表现的改变。3.采用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察5μMTCN对均匀浓度fMLP刺激的F-actin极性分布的影响。4.用GST-pull down方法检测TCN对均匀浓度fMLP诱导Cdc42,Rac2活化的影响。5.用流式细胞仪检测不同浓度TCN (0、5、60、80μM)诱导dHL-60细胞的凋亡率。6.用western blot检测不同浓度TCN (0、O.1、1、 5、10、 20、40、60、80、100μM)预处理dHL-60细胞后对均匀浓度fMLP诱导的Akt磷酸化活性的影响。并针对5μM和60μMTCN,在不同时间点(0、15、30、60 min)及有和无均匀浓度fMLP处理的条件下,分别探究其对dHL-60细胞Akt磷酸化活性的影响。7.采用细胞免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察5μM浓度的TCN预处理对Akt向膜上募集的影响。8.实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示,数据用SPSS13.0进行统计分析多组间比较采用完全随机设计方差分析(one-way ANOVA)分析。多组间的两两比较时先采用Homogeneity-of-variance test检验方差齐性,若方差齐(P>0.05)采用LSD法,若方差不齐(P<0.05)则采用Dunnett, T3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.与对照组相比,经fMLP刺激后的dHL-60细胞极性化率显著升高,TCN预处理dHL-60细胞后,与未预处理组相比,fMLP刺激的细胞极性化率随着TCN浓度升高而降低。当TCN浓度为5μM时,与单独fMLP刺激组相比,细胞极性化显著减弱,尾足也明显变短,且极性化方向不定。TCN升高到10μM时,dHL-60细胞尾足消失,极性化不明显。2.静息状态下,F-actin均匀分布在胞质膜上。用均一浓度为100nM的fMLP刺激5min后,dHL-60细胞发生明显的极性形态变化,F-actin呈极性分布在质膜上,聚集在细胞的片足或伪足上,且荧光增强；用TCN预处理1h后则明显抑制了fMLP所刺激的F-actin极性分布,同细胞静息状态下的表现相似。3.与对照组相比,经fMLP刺激的dHL-60细胞的Cdc42, Rac2活化水平显著性上调,用5μM TCN预处理dHL-60细胞1h后,与未预处理组相比,fMLP刺激引起的Rac2, Cdc42的活化水平显著降低。4.不同浓度TCN (0、5、60、80μM)预处理dHL-60细胞1h后,流式细胞仪检测证实细胞凋亡率随着TCN浓度升高也升高。5.单独fMLP作用可引起Akt在T308和S473两个磷酸化位点均出现明显的磷酸化,在5μM TCN预处理dHL-60细胞1h后Akt磷酸化开始被明显抑制,且随着TCN浓度提高,抑制效果越来越明显。考虑到药物可能的毒副作用,选TCN作为后续实验的TCN浓度。用TCN预处理dHL-60细胞不同时间点(0、 15、30、60 min),再经fMLP刺激,dHL-60细胞Akt的T308和S473位点磷酸化水平随TCN作用时间延长而降低。6.细胞免疫荧光结果显示：经fMLP刺激的dHL-60细胞Akt向膜上募集,而予5μM TCN预处理可以阻止Akt向膜上的募集。结论低浓度TCN可经Akt/Rho GTPases通路参与抑制dHL-60细胞极性化,高浓度TCN促进dHL-60细胞凋亡。