研究背景创面愈合是一个受到精准调控的动态生物学过程。再上皮化是创面愈合的关键环节,主要过程是表皮细胞向创面中心的迁移。诱导表皮细胞迁移的因素包括:损伤刺激、趋化剂梯度、接触抑制、创面空间、邻近细胞生长带来的接触压力以及损伤后机械力的变化等。有研究表明,电场是诱导表皮细胞迁移的众多因素中最重要的因素之一。因此,电场被视为促进创面愈合的高效物理因素,其中研究最为广泛的是持续直流电场(Constant directed current electric field CDCEF)。然而,电流长时间作用于组织,不可避免的会产生电化学反应,通过多种途径对细胞产生毒副作用。脉冲直流电场(Pulse directed current electric field PDCEF)采取间断的給电方式,减少了电场作用时间,脉冲间隙给细胞提供了缓冲时间,理论上可以减轻电场的副作用,让电场能成为真正有效的促愈方法。然而,PDCEF能否诱导细胞迁移,它的三个参数变化对其诱导细胞迁移有何影响,它是否能减轻电场的电化学副作用仍不明确。细胞感受电场的机制尚不明确,可能与电场作用下,细胞膜表面蛋白(转铁蛋白受体、低密度脂蛋白、乙酰胆碱、刀豆蛋白A、免疫球蛋白E和表皮生长因子受体)的再定位有关。细胞感受到电信号后主要通过以下几个通路在胞内进行传递:包括PI3k/AKt途径,MAPk/ERK途径,PKC依赖性途径,ROCK依赖性途径和差异性钙内流。其中以前两种途径为主,相关研究最多,但细胞在脉冲直流电场作用下是否也是依赖该途径传递电信号,目前仍不清楚。在以往研究中,有人采用交流电、直流电、脉冲电来促进皮肤创面愈合,效果不一,均提示电场有促进创面愈合的作用。但由于电场的副作用,人体耐受性很差,导致其不能再临床上广泛运用。猪与人类基因相似度高,且皮肤厚度与人皮肤基本一致,收缩率低,是研究皮肤创面愈合的理想模型。基于细胞实验的结果,脉冲直流电能否促进猪皮肤创面的愈合,相比持续直流电它在哪些方面更有优势需要进一步明确。创面快速愈合的两个必备条件,一是细胞能有效的朝创面中心迁移,二是提高细胞迁移速度。电场诱导细胞定向迁移的同时,可提高细胞的运动性。我们以往研究表明,生理强度的持续直流电在短时间内可促进细胞运动且依赖于自噬的激活,抑制自噬可抑制细胞在电场下的运动。那么长时间的电场在体运用,对组织细胞的自噬水平有何影响,PDCEF是否通过诱导自噬促进创面愈合,PDCEF与CDCEF诱导细胞自噬水平是否相同目前均不清楚。因此本研究将观察细胞在PDCEF作用下的运动情况和运动特性。同时对比检测PDCEF和CDCEF对培养微环境的改变,并进一步探讨PDCDF诱导细胞电趋性的潜在机制。此外,我们还将通过建立猪在体皮肤创面加电模型,明确PDCEF对创面的促愈作用及其机制。研究方法1.利用外源性细胞加电模型,观察原代表皮细胞在PDCEF作用下的运动,Image J软件定量分析细胞运动方向和运动速度。调节PDCEF的三个参数,观察每个参数变化对其诱导细胞电趋性的影响。检测PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)和CDCEF(150mV/mm)作用6h时间后,细胞培养环境的电化学改变并对比细胞的增殖情况。MAPK/ERK通路抑制剂U0126(50μM)用来处理原代表皮细胞,检测该通路在PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)诱导原代表皮细胞电趋性的作用。分别检测原代表皮细胞在不同场强和不同作用时间的PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)和CDCEF(150mV/mm)两种电场作用下,ERK的磷酸化水平,明确该分子磷酸化在细胞电趋性中的作用。进一步观察原代表皮细胞在PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)中1.5h后再关闭电场后2h内,细胞运动方向性的变化,以及ERK磷酸化的变化,明确细胞运动及ERK磷酸化水平与电场持续作用的关系。2.利用巴马香猪构建在体皮肤创面加电模型。通过该模型,观察创面在PDCEF(3V、0.1Hz、60%)和CDCEF(3V)两种电场作用下3天、6天、9天及12天的愈合情况。将组织切片进行HE染色、Masson染色对比两种电场作用下,创面血管、肉芽、胶原增生情况,明确两种电场的具体促愈作用及差异。红外温度仪及高精度pH试纸检测两种电场作用后创面温度及pH的变化,明确及对比两种电场对创面微环境的改变情况。3.取下PDCEF、CDCEF在体作用3天、6天、9天后的创面皮肤组织,提取组织蛋白,WB检测LC3及ATg5的表达情况,明确两种电场作用不同时间后组织细胞自噬水平的变化。同理,通过组织切片免疫荧光法检测LC3的表达,明确两种电场作用不同时间后组织细胞自噬水平的变化。4.在体外,提取原代表皮细胞在PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)和CDCEF(150mV/mm)两种电场作用下0h、2h、5h、8h后的细胞总蛋白,Western blot检测LC3及Atg5的表达情况,明确在细胞水平两种电场作用不同时间后细胞自噬的变化。利用外源性细胞加电模型,观察原代表皮细胞在PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)和CDCEF(150mV/mm)两种电场作用下0h、2h、5h、8h后的细胞运动性,明确在细胞层面,两种电场长时间作用后细胞运动性的变化。利用lipofectamine 2000和Atg5干扰RNA,制作干扰Atg5及LC3表达的原代表皮细胞,并将细胞分为空载组、空载加电组、Atg5干扰加电组,在体外PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)作用5h后收集细胞总蛋白检测自噬分子LC3,明确siAtg5对电场中细胞自噬激活的抑制作用。同法将干扰Atg5表达的原代表皮细胞置于电趋性加电模型中,在PDCEF(150mV/mm、0.1Hz、60%)作用下观察细胞运动5h,明确自噬对电场诱导细胞运动的作用。结果1.PDCEF能够明显诱导原代表皮细胞电趋性,且其诱导电趋性作用具有场强依赖性、脉宽依赖性、时间依赖性。PDCEF的脉宽达到一定阈值后,能达到与CDCEF相当的细胞电趋性诱导作用,且场强越大,所需阈值脉宽越低。PDCEF所导致的培养基、电解液pH和温度变化明显低于CDCEF,且在CDCEF作用后,细胞增殖明显降低,而PDCEF作用后的细胞增殖水平无明显变化。2.MAPK/ERK通路被U0126抑制后,PDCEF诱导细胞电趋性的作用明显降低,WB结果提示,U0126可明显抑制ERK在PDCEF作用下的磷酸化。原代表皮细胞在PDCEF和CDCEF作用下ERK的磷酸化水平具有场强依赖性和时间依赖性,且在PDCEF中p-ERK达到峰值的时间稍晚于细胞处于CDCEF中0.5h。细胞在PDCEF中作用1.5h后去掉电场,细胞电趋性不会立刻消失,在短时间内仍保持明显的电趋性,类似的结果出现在p-ERK的去磷酸化过程中,去磷酸化也是一个缓慢的过程,短时间内变化不明显。3.在猪皮肤创面模型中,生理强度的PDCEF、CDCEF均能促进创面愈合,其中PDCEF效果最显著。相比CDCEF,PDCEF在促进创面血管形成、肉芽增生、胶原形成方面要优于持续直流电。对比检测在体创面微环境(pH、温度)改变,发现:PDCEF导致的创面pH和温度改变要明显低于CDCEF,更利于创面内环境的稳定。4.在组织水平上,WB结果和组织切片免疫荧光结果均提示PDCEF能明显提高自噬水平,而在CDCEF作用下,自噬水平有降低趋势。细胞结果提示:细胞在PDCEF作用下其自噬持续保持高水平,而在CDCEF作用下细胞自噬水平先增高,后降低。类似的结果出现在细胞的运动性中,在PDCEF作用下8h,细胞持续保持较高的运动性,而在CDCEF作用下,细胞运动性短时间内同样有所提高,但5h后明显降低。抑制细胞自噬激活后,细胞在PDCEF作用下5h,其运动性较电场中的正常细胞明显降低。结论1.PDCEF能在降低电场副作用的同时达到与CDCEF等效的细胞电趋性诱导作用,且它的三个参数变化均能影响其电趋性诱导作用。2.ERK分子是PDCEF诱导表皮细胞电趋性的重要分子之一,PDCEF通过诱导与CDCEF相当的ERK磷酸化水平达到与其等效的电趋性诱导作用。3.PDCEF可显著诱导猪在体创面的愈合,且在促进肉芽生长及维持创面微环境稳定方面优于CDCEF。4.PDCEF可通过提高组织和细胞自噬水平,增加细胞运动性,这是其促进创面愈合的潜在机制。本课题研究了生理强度脉冲直流电诱导细胞电趋性,促进创面愈合的作用及其相关机制,深化了人们对创面内源性电场及运用外源性电场促进创面愈合的认识,也为临床创面治疗提供新的思路。