一.研究背景弓形虫是一种古老的顶复门单细胞原虫,严格胞内寄生及感染几乎所有来自于温血动物的有核细胞。据血清流行病学调查,全球约有1/3的人口曾感染或感染弓形虫,在法国等西欧地区血清阳性率甚至可高达80%。弓形虫作为一类重要的机会性致病原虫。人体急性感染转为慢性感染后,正常机体免疫力的宿主主要表现为无任何临床体征及症状的隐性感染;而在一些免疫功能低下或机体免疫系统被破坏的宿主如肿瘤患者、艾滋病人及器官移植患者等的体内,处于“休眠”的包囊则会转化为速殖子并迅速增生繁殖,引起占位性病变、破坏宿主细胞而引起多器官、多脏器的损害,严重者可导致宿主死亡。若雌性宿主在孕前期感染弓形虫,可导致畸胎、流产、死胎等不良后果,胎儿幸存者也常遗留智力低下、发育迟缓等预后不良。因此弓形虫也是一种影响深远且广泛,可引起严重不良后果的人兽共患的寄生原虫。巨噬细胞,也称为吞噬细胞,是一种广泛分布于组织和血液循环内的多功能免疫细胞。巨噬细胞主要来源于先天胚胎发育来的原始巨噬细胞以及后天骨髓中的前体细胞发育而成的单核细胞。巨噬细胞对生物体正常发育、体内平衡、组织修复和对病原体的免疫反应中扮演了重要的角色。其在脊椎动物体内参与非特异性防御(先天性免疫)和特异性免疫(细胞免疫)的免疫反应过程。巨噬细胞的先天性免疫功能主要通过吞噬作用完成。它的主要功能是以组织特异性巨噬细胞细胞或单核细胞的形式,对已受损或已感染的组织体内细胞残体、肿瘤及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)。病原体释放的危险信号与巨噬细胞表面的受体结合触发巨噬细胞对病原体的吞噬作用和杀伤作用。这个过程主要是通过“呼吸爆发”引起的活性氧(NO等)的释放而发挥作用,进一步激活的巨噬细胞也会产生趋化因子,正反馈吸引更多炎症细胞参与防御。巨噬细胞的另一个重要作用就是参与特异性细胞免疫。在病原体被消化后,巨噬细胞会将這些抗原整合至细胞膜,并把抗原结合在主要组织相容性复合体Ⅱ型分子(MHCⅡ)上并分泌细胞因子(IL-12),刺进相应的辅助型T(Th1)细胞并激活淋巴细胞、B细胞等免疫细胞,令机体产生抗体使得吞噬细胞可以更好地清除病原体,以保护机体免受侵害。近年来随着研究的深入,人们发现除了我们熟知的经典的M1型巨噬细胞参与促炎反应,且在宿主防御细菌、病毒、寄生虫等病原体感染中发挥核心作用外,还有另外一种非经典途径激活的M2型巨噬细胞。M2巨噬细胞,又名替代激活的巨噬细胞,主要由辅助2型T细胞(Th2)产生的细胞因子IL-4、IL-10刺激的磷酸化STAT6通路激活。其功能上与抗炎反应、寄生虫感染、组织修复、纤维化以及肿瘤疾病发展与转移相关。与M1型巨噬细胞发挥促进炎症反应、抵抗病原体的作用相反,M2型巨噬细胞具有免疫调节作用,抑制炎症反应的进行,帮助病原体逃避免疫监控、防御,是病原体在体内繁殖的天然温床。因此,探究病原体与宿主巨噬细胞的相互调控作用机制,对认识病原体调控宿主免疫功能、发现免疫细胞促炎、抗炎作用转换机制,以及找到调控免疫炎症的新的药物作用靶点都有巨大的意义。本研究首次对宿主巨噬细胞和弓形虫的相互作用机制展开系统性的研究。利用TypeⅢ弓形虫(CEP株)可以在体内、外激活经典型(M1型)和非经典型(M2型)巨噬细胞这一特性,明确了宿主感染弓形虫后分别激活M1型和M2型巨噬细胞的活化机制,并深入阐述了 M1和M2型巨噬细胞对弓形虫感染宿主后的预后及其影响。尤其是ROP16蛋白通过STAT6磷酸化通路激活M2型巨噬细胞,在一定程度上竞争性抑制了 M1巨噬细胞的活化及其下游抵抗病原体通路基因的表达。除此之外,ROP16蛋白抑制了细胞因子,如:IL-12、IFNγ等产生,进一步抑制了宿主免疫反应。值得注意的是,我们发现ROP16蛋白可特异性抑制效应T细胞、弓形虫特异性T细胞的激活,也影响了特异性激活的CD8+T细胞的杀伤效应。与此同时,本研究利用弓形虫与宿主相互作用的“Kiss and Run”模型发现弓形虫仅仅通过注射ROP蛋白就可改变宿主细胞巨噬细胞的生物学特性。这一普遍存在于病原体与宿主相互作用中的“注射现象”,也提示我们病原体与宿主细胞的信息沟通并不是我们简单理解的感染与未感染的现象,而应该是全方位的、多维度的接触与交流。由于ROP蛋白的注射早于弓形虫对宿主细胞的入侵,而GRA蛋白的分泌晚于入侵。这一研究还使我们认识到弓形虫入侵细胞的过程是个逐步展开,层层深入并改变宿主细胞生物学特性的过程。当弓形虫入侵宿主巨噬细胞前,就已经可以改变巨噬细胞的极性和激活状态,为弓形虫的进一步入侵创造了良好的条件。总之,本研究通过研究宿主巨噬细胞与弓形虫相互作用的机制,阐述了弓形虫入侵宿主的阶段式过程,明确了弓形虫激活巨噬细胞经典激活通路和非经典激活通路的活化机制及其免疫学效应,并探讨了弓形虫ROP16对于宿主免疫系统尤其是T细胞的调控,为深入理解巨噬细胞的生物学特性、阐明弓形虫入侵机制奠定了坚实的基础。