山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3）为本课题组从山羊中分离出一株新的病毒,其属于副粘病毒科（Paramyxoviridea）副粘病毒亚科（Paramyxovirinea）呼吸道病毒属（Respirvirus）的单股负链有囊膜的RNA病毒。CPIV3可通过水平传播感染周围圈舍的健康羊群,引起患病羊出现流涕、高热和精神不振等临床症状,病羊剖检后发现其肺部和上呼吸道出现较为严重的病变,并可连续检测到病毒血症和排毒,由此可见CPIV3有很强的传染力和致病性。因此,CPIV3给养羊业的健康发展带来的威胁应该引起重视。MicroRNAs（miRs）是一种长为19-25 nt左右的单链RNA,可以靶向结合某些蛋白分子形成沉默综合体（RISC）进而抑制m RNA的翻译或使m RNA降解,从而介导基因的表达。研究表明,病毒感染可引起宿主miRs表达谱的改变,而发生差异表达的miRs常常参与到对病毒复制的调控中来。因此,miRs在抗病毒感染和天然免疫反应中扮演着重要作用。为研究CPIV3是否可以在牛肾上皮细胞（Madin-darby bovine kidney cells,MDBK）细胞中诱导miRs发生差异表达,有研究把CPIV3感染MDBK细胞,基于高通量测序技术,发现CPIV3可在MDBK细胞诱导大量的miRs发生差异表达,其中差异较显著的有bta-miR-677。通过GO、KEGG和Target Scan等生物信息软件分析发现,bta-miR-677可能在I型干扰素、炎性因子和凋亡通路中起着重要作用。因此,本研究通过合成bta-miR-677 mimics/inhibitor（模拟物或抑制物）,将其转入MDBK,让bta-miR-677在MDBK中过/抑制表达,并探讨bta-miR-677调控I型干扰素通路抑制山羊副流感病毒增殖的分子机制,为研究基于bta-miR-677防控CPIV3的分子药物提供重要的科学基础。1.Bta-miR-677对CPIV3的调控作用为探索bta-miR-677对CPIV3的调控作用,本研究让bta-miR-677在MDBK细胞中过表达或抑制表后接种CPIV3病毒液,通过q RT-PCR和TCID₅₀检测病毒载量。结果显示,转染bta-miR-677 mimics可显著抑制CPIV3增殖,转染组bta-miR-677 mimics病毒拷贝数低于NC组和对照组4-7倍,转染组病毒复制效价(10^2.2TCID₅₀-10^2.6TCID₅₀)显著低于NC组和对照组(10^3.5TCID₅₀-10^4.3TCID₅₀)。相反的,抑制bta-miR-677表达可显著促进CPIV3增殖,转染组病毒拷贝数高于NC组和对照组3-6倍,病毒复制效价(10^4.1TCID₅₀-10^5.3 TCID₅₀)显著高于NC组和对照组(10^3.5 TCID₅₀-10^4.2 TCID₅₀)。结果表明,bta-miR-677可抑制CPIV3的增殖。为研究bta-miR-677抑制CPIV3增殖的机制,将bta-miR-677 mimics/inhibitor转染MDBK细胞,检测干扰素（Interferon,IFN）以及干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISGs）的转录水平。结果显示,过表达bta-miR-677组I型干扰素转录水平显著上调,转染组IFN-α/IFN-β上调2-4倍左右,IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2上调2-16倍。与之相反,转染bta-miR-677 inhibitor组I型干扰素转录水平显著下调,转染组IFN-α/IFN-β比对照组下调2倍左右,IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2下调2-3倍。结果表明,过表达bta-miR-677可促进I型IFN及ISGs的生成,进而抑制CPIV3的复制,抑制bta-miR-677可抑制I型IFN及ISGs的生成,进而促进CPIV3的复制。2.Bta-miR-677调控I型干扰素的分子机制为研究bta-miR-677促进IFN-α或IFN-β的分子机制,我们通过Target Scan等miRs靶基因预测软件分析得知,bta-miR-677可靶向与I型干扰素相关的因子线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondria antiviral signaling protein,MAVS）,随后通过建立双荧光素酶报告基因系统、q RT-PCR和Western blot等实验进行验证。结果显示,MAVS的荧光酶活性低于对照组2-3倍,转录水平无显著变化,MAVS的蛋白水平显著降低。结果表明,bta-miR-677可在蛋白水平抑制MAVS的表达。应用Ambion在线软件,筛选MAVS的siRNAs,从推荐的靶序列中选择3条干扰分值较高的序列,另外设计一个与目的基因无关的si RNA序列作为阴性对照,记为Negative Control（NC）,将合成的四条si-MAVS转染于MDBK细胞,通过q RT-PCR检测各个基因转录水平。结果显示,转染si-MAVS后能够显著降低MAVS转录和表达（P<0.001）,提高I型IFN的转录水平4-6倍,IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2也上调4-17倍。将转染si-MAVS转染于MDBK细胞后接种CPIV3,通过q RT-PCR和TCID₅₀检测发现,转染组CPIV3的拷贝数显著低于对照组6倍左右,病毒复制效价(10^1.8TCID₅₀)显著低于对照组(10^3.5TCID₅₀)。结果表明MAVS基因敲减可上调I型IFN和IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1、MX2的转录水平,并可抑制CPIV3的复制。综上所述,bta-miR-677通过靶向抑制MAVS的蛋白水平促进I型IFN和ISGs的生成进而抑制CPIV3的复制。3.建立稳定过表达bta-miR-677的MDBK细胞系本研究利用慢病毒系统建立稳定过表达bta-miR-677的MDBK细胞,以便于进行bta-miR-677分子机制的探索。首先,利用PCR技术扩增出pri-bta-miR-677片段以及增强型绿色荧光EGFP片段,将获取的EGFP和bta-miR-677基因片段克隆于pMD18-T载体中,获得pMD-miR-677和pMD-EGFP,酶切鉴定及测序正确后,先将EGPF克隆于PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体,构建含增强型绿色荧光蛋白EGFP的重组质粒PCDH-EGFP,随后在将bta-miR-677基因的克隆于重组质粒PCDH-EGFP获得含bta-miR-677的重组质粒PCDH-miR-677-EGFP。经双酶切鉴定和测序结果正确后,将PCDH-miR-677-EGFP、PSP和PMD共同转入293FT,让该系统在细胞内包装出含bta-miR-677基因的重组慢病毒VPCDH+miR-677。将VPCDH+miR-677病毒液接入MDBK,使用Puromycin杀死不含PCDH-miR-677-EGFP的MDBK进行纯化,传代至第十代后,用荧光显微镜观察MDBK细胞绿色荧光和q RT-PCR检测bta-miR-677的表达。结果显示,可以在接毒组中看到大量的绿色荧光,与正常MDBK相比,bta-miR-677在MDBK-miR-677细胞系中过表达128倍。接种CPIV3于MDBK-miR-677细胞系,同时设立CPIV3感染正常MDBK为对照组,通过q RT-PCR和TCID₅₀检测。结果显示,CPIV3拷贝数低于对照组6-64倍,病毒复制效价(10^1.7TCID₅₀-10^2.1 TCID₅₀)显著高于对照组(10^3.3TCID₅₀-10^4.7TCID₅₀)。结果表明,bta-miR-677稳定过表达于MDBK-miR-677细胞系,并且该细胞系可抑制CPIV3的复制。这为将来深入探索bta-miR-677在CPIV3感染MDBK细胞的作用机制奠定基础。4.Bta-miR-677体内抑制CPIV3的效果的初探为研究bta-miR-677在体外是否有抑制CPIV3增殖的作用,本研究将过表达质粒PCDH-miR-677-EGFP按每只豚鼠80 mg/kg肌肉注射,3d后取豚鼠肺和气管提取RNA。经q RT-PCR检测,注射PCDH-miR-677-EGFP可使miR-677在豚鼠体内过表达168倍。在给豚鼠注射PCDH-miR-677-EGFP质粒3d后,以滴鼻的方式按每鼠接种300μL已稀释为10^-5.0/100μL CPIV3病毒液,设立给药攻毒组和正常对照组,每日观察豚鼠表现症状,7d后将所有豚鼠处以安乐死,取肺部和气管组织一份提取RNA用于q RT-PCR检测,另一份用于病理组织学检查。剖检观察豚鼠,发现攻毒组豚鼠于攻毒后第7d的肺部出现充血、实变和肿大的症状,而免疫攻毒组豚鼠肺部仅出现轻微的肿大。q RT-PCR检测发现,攻毒组实验豚鼠肺部检出病毒核酸拷贝数高于对照组6-64倍,而给药攻毒组肺部病毒核酸拷贝数仅高于对照组6-12倍。病理组织学观察鉴定发现,攻毒组实验原鼠肺部组织出现较明显的肺泡间隔增宽、肺泡融合、炎性细胞浸润等变化;而给药攻毒组豚鼠只出现轻微的病变。结果表明,通过肌肉注射PCDH-miR-677-EGFP可使bta-miR-677于豚鼠体内过表达,且可在豚鼠体内有效抑制CPIV3增殖。综上所述,本研究验证了bta-miR-677在天然免疫抗病毒过程中的重要作用,鉴定了bta-miR-677的一个靶基因MAVS,揭示了bta-miR-677调控I型干扰素以及炎性因子表达的分子机制,证实了bta-miR-677抑制CPIV3增殖的分子机制,为进一步研发bta-miR-677作为治疗CPIV3感染的药物提供了科学基础。