论文部分内容阅读
背景与目的自1978年首例试管婴儿路易斯·布朗在英国诞生之后，辅助生殖技术(Assisted reproductive teachnology,ART）已发展30余年，迄今为止已有约四百万辅助生殖技术子代诞生。流行病学调查显示：近年来每年约两百万ART子代诞生。由于ART是首个未经临床安全性评估而直接应用于临床治疗的技术，其安全性受到人们越来越多的关注。文献报道：ART子代不良妊娠结局如自然流产、低出生体重儿、早产、胎儿畸形、围产期死亡及脑瘫等的发生率也逐渐增加。目前表观遗传学研究已成为ART子代安全性研究研究的焦点，认为ART的体外操作过程可能干扰子代印记基因的表达，特别是与生长发育相关的印记基因。大量文献报道：ART妊娠可增加子代患普-威综合症(Prader-willi syndrome,PWS)、银罗素综合征（Silver-Russell syndrome, SRS)、安吉尔曼综合症(Angelmansyndromen,AS)、韦-伯综合症(Beckwith-wiedemamm,BWS)等印记疾病的风险。因此本课题选择与ART子代生长发育密切相关的印记基因PEG10、L3MBTL1进行研究，观察目的基因在ART子代胎盘表达情况，并探讨辅助生殖技术的安全性。胎盘是胎儿在母体内获得营养及物质交换的场所，对胎儿生长发育起重要作用。许多印记基因均表达于胎盘组织中，ART操作可能导致印记基因表达异常。PEG10(Paternally expressed gene10)是一父系印记基因，由Ryuich ono等在2001年利用cDNA微阵列在肝癌中所发现，其定位于人类7号染色体长臂2区1带(7q21.3)，在胎盘、脑、肾脏、肝脏、卵巢及睾丸等组织内均有表达，其编码的蛋白与胎儿生长、胎盘形成及滋养细胞分化密切相关。研究发现：敲除小鼠胚胎中PEG10基因会导致小鼠胎盘发育异常，并增加流产率及早期胚胎死亡率。PEG10在自然流产、难免流产组织中均呈低表达状态，在肝癌及胃癌组织中呈高表达。父系印记基因L3MBTL1(Paternally expressed gene L3MBTL1)位于20号染色体长臂13区12带(20q13.12)上，在胎盘、造血祖细胞及肿瘤组织中表达，主要参与和维持细胞正常有丝分裂，其编码的蛋白可抑制脑部恶性肿瘤的生长。在白血病细胞、异常增生的骨髓细胞中呈低表达甚至无表达。敲除小鼠胚胎中L3MBTL1基因可导致胚胎干细胞向滋养外胚层分化障碍，影响胎盘及胚胎正常发育。我们前期研究应用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测自然妊娠子代胎盘与ART子代胎盘中印记基因PEG10、L3MBTL1mRNA表达水平的变化；应用甲基化特异性PCR技术（MSP）检测基因PEG10、L3MBTL1甲基化状态并作一比较，结果显示：ART组胎盘组织中印记基因PEG10mRNA表达与自然妊娠组胎盘相比，其表达有上调趋势；而印记基因L3MBTL1mRNA在ART组胎盘组织中表达与自然妊娠组比较呈下调趋势；ART组胎盘中PEG10启动子区甲基化阳性率均低于自然妊娠组， ART组胎盘组织中L3MBTL1启动子区甲基化阳性率均高于自然妊娠组。认为ART组胎盘组织中PEG10、L3MBTL1异常表达可能与母体及子代出生不良妊娠结局有关。本研究后续上述实验，我们拟采用免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹法(Western Blotting,WB)对印记基因PEG10、L3MBTL1蛋白表达进行研究，明确其组织学定位，并从蛋白水平探讨辅助生殖技术对上述蛋白表达的影响。材料和方法1.收集30例ART来源的胎盘组织和33例自然妊娠来源的胎盘组织，对患者基本情况及妊娠结局进行比较。2.对胎盘组织行常规HE染色，利用光学显微镜观察并比较两组不同来源的胎盘组织形态学上的差异。3.利用免疫组化技术比较ART组胎盘与自然妊娠组胎盘印记基因PEG10、L3MBTL1的组织学定位及半定量分析上述两个基因蛋白表达的差异。4.利用Western Blotting技术定量分析ART组胎盘与自然妊娠组胎盘印记基因PEG10、L3MBTL1蛋白表达的差异。5.利用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料（对称分布）用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以α=0.05为检验水准。结果1.两组产妇的年龄、孕期增重、脐带长度等方面相比较均无统计学意义（P>0.05）。ART组出生子代体重及身长、胎盘重量均低于自然妊娠组子代，但差异不具有统计学意义。2.两组胎盘行常规HE染色结果显示：ART组胎盘和自然妊娠组胎盘均存在典型的绒毛结构，胎儿血管丰富，无明显钙化及水肿，少量炎细胞浸润，胎盘结构基本正常。3.免疫组化显示：PEG10、L3MBTL1蛋白在两组胎盘组织内均有表达，且均定位于胎盘间质细胞胞质中，在胞核中不表达。PEG10蛋白在ART组子代胎盘组织中表达有增高趋势，与自然妊娠子代胎盘组织相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。L3MBTL1蛋白在ART子代胎盘组织中呈下降趋势，与自然妊娠子代胎盘组织中表达相比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。4. Western Blotting显示：各样本中的PEG10均在55kDa及37kDa处出现目的蛋白及内参蛋白（GAPDH），各样本中的L3MBTL1均在84kDa及37kDa处出现目的蛋白及内参蛋白（GAPDH）。印记基因PEG10、L3MBTL1蛋白表达规律与前期研究的mRNA表达规律基本一致，即ART子代胎盘组织中PEG10与自然妊娠相比呈增加趋势，ART子代胎盘组织中L3MBTL1与自然妊娠相比呈下降趋势。结论1、印记基因PEG10、L3MBTL1在正常胎盘组织中均有表达，认为两者均参与胎盘的形成及发育，并参与正常妊娠的维持；2、印记基因PEG10在ART子代胎盘组织中处于高水平状态，而印记基因L3MBTL1在ART子代胎盘组织中处于低水平状态，可能会增加ART子代出生不良结局的风险。