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干旱和土壤盐渍化等非生物逆境,严重制约了作物生长发育和地理分布,是造成农作物产量下降甚至绝收的原因之一。提高作物抵抗逆境胁迫的能力,具有重要的理论和现实意义。植物为了适应或抵抗不利环境,在进化过程中逐步形成了一定的抗逆机制来减轻胁迫伤害。矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus)与蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongollcus)同属豆科沙冬青属,是第三纪古地中海消失后,在气候旱化过程中逐渐适应,并在塔里木盆地西部幸存下来的残遗物种。对其干旱瘠薄的恶劣环境有极强的适应性,是我国西部荒漠地区唯一常绿阔叶灌木。克隆矮沙冬青抗逆相关基因,异源转化表达验证其功能,可为抗逆转基因育种提供基因资源。 本实验用前期克隆的矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因AnBADH,构建双子叶植物表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型烟草品系“W38”,对转基因烟草株系进行抗逆相关测定,得到如下结果: 1.通过农杆菌介导法转化烟草,经潮霉素初步筛选后获得58个抗性植株,PCR检测鉴定,其中20个植株为阳性,扩增条带大小和质粒一致,说明AnBADH基因插入到烟草基因组中。 2.选取H13、H16和H22三个阳性转基因烟草T1株系的种子,在含有20 mg·L-1潮霉素的MS培养基上做发芽试验,分别并移栽至含有200 mmol·L-1 NaCl和200mmol·L-1甘露醇的MS固体培养基上,模拟高盐、干旱胁迫,观察测定其形态变化。结果表明,转AnBADH基因烟草株系的幼苗在干旱和高盐胁迫胁迫条件下均能够正常生长,与野生型对照相比,植株健壮,侧根发达,根系更长,具有一定抵抗干旱和高盐胁迫的能力。 3.经抗生素筛选和PCR检测的H13、H16和H22的T1代阳性株系,用10%的聚乙二醇6000和300 mmol·L-1的NaCl模拟干旱和高盐胁迫,测定叶片的相对电导率,以及叶片中甜菜碱、游离脯氨酸、丙二醛和可溶性糖的含量。结果表明,干旱胁迫下转基因和野生型植株甜菜碱含量差异不明显,转基因株系可溶性糖含量明显增加,转基因H13和H16两个株系的游离脯氨酸含量增加,H22株系的丙二醛含量在胁迫之后明显降低,转基因株系相对电导率在干旱胁迫第2d和第3d显著低于野生型对照。高盐胁迫下,转基因和野生型植株甜菜碱含量变化差异不明显,转基因株系可溶性糖含量明显增加,游离脯氨酸含量均有所上升,而丙二醛含量明显减少。转基因株系相对电导率在高盐胁迫第2d显著低于野生型对照。 4.在自然干旱条件下,转基因烟草株系耐受能力强于野生型,在干旱处理28 d后,上部叶片仍然保持绿色,而野生型对照呈现严重脱水症状。复水后转基因株系能够迅速恢复正常生长,叶片挺立,但野生型植株叶片仍呈萎焉状态。 从上述几方面的试验结果看,转化AnBADH基因的烟草株系在干旱和高盐胁迫下,细胞能迅速积累渗透调节物质,细胞膜过氧化程度减轻,透性降低,植物耐受性增强,说明克隆的矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因AnBADH具有较好的抗逆功能,进一步验证后可用于作物转基因改良。