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赭曲霉毒素(Ochratoxin)是某些曲霉及青霉属的菌种在某些特定条件下代谢产生的分子结构类似的一组化合物,包括7种结构类似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)毒性最强,分布最广,对人类和动物影响最大。OTA主要污染谷物、玉米、花生、棉籽、坚果、咖啡豆、水果等多种农产品。OTA主要具有肾毒性、肝毒性、免疫抑制等毒性作用。目前OTA的主要检测方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱串联法、薄层层析色谱法,酶联免疫吸附法等国标规定的检测方法,以及胶体金免疫层析等快速筛查的方法。纳米抗体(Nanobody,Nb),通过克隆驼源动物体内天然存在的重链抗体可变区获得,是目前已知最小的抗原结合单位。纳米抗体具有良好的热稳定性及水溶性,可以通过多种表达体系顺利表达等特点,在医学诊断领域及食品安全领域有较广泛的应用前景。可用于小分子多聚化的结构较多,本研究采用谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)及霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit,CTB)分别构建二价抗OTA纳米抗体GST-VHH及五价抗OTA纳米抗体CTBVHH,并建立基于CTB-VHH的OTA的酶联免疫吸附检测方法,主要研究结果如下:1.二价及五价纳米抗体的原核表达及活性分析成功构建二价纳米抗体GST-VHH及五价纳米抗体CTB-VHH表达菌株,并进行IPTG诱导表达,经纯化后得到纯度较高的GST-VHH及CTB-VHH。通过SDS-PAGE电泳发现,GST-VHH主要以单体形式存在,CTB-VHH主要以五聚体形式存在。经间接竞争ELISA测定得到GST-VHH、CTB-VHH的IC50分别为2.11 ng/mL、0.65 ng/mL。通过不同温度梯度下孵育一段时间后进行ELISA测定GST-VHH及CTB-VHH的热稳定性,结果表明GST-VHH于50.21℃下孵育5min后失去一半活性,CTB-VHH于65.64℃下孵育5 min后失去一半活性,二者耐热性较VHH单体均有一定程度下降。2.五价纳米抗体CTB-VHH的应用研究建立了基于CTB-VHH的间接竞争ELISA检测方法,IC50 0.65 ng/mL,线性范围0.27~1.58 ng/mL,LOD 0.095 ng/mL。本研究建立的检测方法与其他真菌毒素无明显交叉反应,批内加标回收率80.0~108.4%,批内变异系数2.51~7.48%,批间加标回收率84.7~99.6%,批间变异系数2.61~4.79%。本研究建立的OTA检测方法检测实际样本结果与商品化试剂盒检测结果相关性良好,表明可以运用于实际样品检测。