人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)通常来源于胚胎发育过程中囊胚的内细胞团(Inner Cell Mass, ICM),具有发育全能性的特点,被认为是再生医学最重要的种子细胞之一。以干细胞为核心的再生医学越来越受到科学家及临床工作者的关注。hESCs通过移植、分化与组织再生促进机体创伤修复,治疗疾病。尽管hESCs发展前景很好,但是仍存在安全风险。目前尚未明确hESCs在长期传代培养和诱导分化过程中基因组是否存在动态变异以及遗传特征是否稳定。因此,要把hESCs应用于临床治疗首先要明确hESCs是否安全可靠。深入探索hESCs种子细胞的遗传稳定性及相关分子机制,对于hESCs的科学研究和临床应用具有重要意义。但是目前国内外尚缺乏从建系、长期传代培养以及诱导分化过程中对遗传变异的系统研究。本研究认为在建系早期就要明确hESCs的遗传特征,伴随传代培养,遗传变异是否会增加,在后续的诱导分化过程中遗传变异的变化是否会继续存在,这是hESCs临床应用的瓶颈。因此利用辅助生殖技术中人的废弃胚胎建立hESCs,在传统G显带鉴定核型的基础上,进一步应用单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)芯片对hESCs基因组DNA进行分子细胞遗传学检测,明确建系早期hESCs的遗传变异特征；继而应用SNP芯片监测人胚胎干细胞长期传代培养过程中基因组遗传变异的动态变化和甲基化芯片检测基因组的甲基化状态,对每株hESC系都进行了SNP、拷贝数变异(Copy Number Variants, CNV)、杂合性缺失(Loss Of Heterozygosity, LOH)和甲基化的检测,全面评价了hESCs基因组的分子遗传学变化；利用拟胚体途径将hESCs诱导分化为神经前体细胞,提取基因组DNA应用SNP芯片检测不同传代数的克隆诱导而来的神经前体细胞基因组变异特征,研究诱导分化过程对基因组遗传变异的影响,为今后细胞移植的安全性提供理论依据和实践基础。本研究的主要创新点：①用异常原核受精卵和劣质胚胎建立正常核型的hESC系,并用SNP芯片对hESC系进行分子细胞遗传学鉴定。②研究混合饲养层长期传代培养过程中hESC基因组SNP、CNV、LOH和甲基化的变化。③研究hESC系向神经细胞诱导分化过程中,神经前体细胞基因组的SNP、CNV、LOH的变化。经查新未见相同研究。第一部分人废弃胚胎来源的胚胎干细胞系的建立及遗传变异的鉴定目的：建立hESC系并进行全面鉴定。建立hESC系的SNP芯片检查方法,分析hESC系的基因遗传特征,建立hESC系与已知疾病相关的基因组CNV遗传信息档案。方法：1.收集郑州大学第一附属医院生殖医学中心体外受精一胚胎移植(In Vitro Fertilization Embryo Transfer, IVF-ET)或卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(Introcyto Plasm Sperm Injection Embryo Transfer, ICSI-ET)患者的新鲜废弃胚胎,序贯培养到囊胚阶段。患者签署知情同意书。2.采用机械法分离囊胚内细胞团,将其种植于小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞按1：1混合的饲养层上,机械传代法传代纯化,建立hESC系。3.对hESC系进行全能性鉴定,用免疫荧光检测表面抗原SSEA-1、SSEA-4、 TRA-1-60和TRA-1-81的表达；RT-PCR法检测OCT4(POU5F1)、SOX2和NANOG基因mRNA的表达。4.传统G显带进行核型分析,同时应用高分辨率Infinium High-Density HumanCytoSNP-12DNA芯片检测hESC基因组DNA的CNV和LOH,分析1hESCs和疾病相关的分子遗传学背景。结果：1.432名IVF/ICSI周期患者的772枚新鲜废弃胚胎,经序贯培养形成117个囊胚,囊胚形成率15.2%,优质囊胚58枚,优质囊胚率7.5%。分离扩增117枚ICM,共建立6个1hESCs细胞系：0PN来源1个系,2PN Ⅳ级胚胎来源1个系,1PN来源2个系,3PN来源2个系。2.6个hESCs细胞系表面抗原SSEA-1呈阴性表达,SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81呈阳性表达,PCR检测OCT4(POU5F1)、SOX2和NANOG基因的mRNA均有表达。3.6个hESCs体外可以分化为拟胚体,并且表达三胚层标记物神经巢蛋白、心肌肌钙蛋白和甲胎蛋白；体内可以分化为畸胎瘤。4.NO19P25(3PN)、NO20P24(3PN)和NO21P17(2PN IV)G显带核型分析结果均为46,XY。5.N019P25和N020P24分别有7个缺失,N021P17有2个扩增、5个缺失。N020P24的11p11.2-11p11.12上存在2.98Mb的缺失。6.NO20P24的Xq28有一个长度为2.2Mb的LOH,涉及相关基因84个；N021P17的1lp11.2-1lp11.12有一个长度为3.6Mb的LOH,涉及相关基因16个。结论：1.异常原核受精卵可以发育成优质囊胚,建立正常核型的hESC系。2.用SNP芯片分析]hESC系的分子细胞遗传学特征,可以为其提供与已知疾病相关的“身份鉴定”。第二部分人胚胎干细胞长期传代培养过程中基因组遗传变异和甲基化的动态变化目的：对建立的hESC系进行长期传代培养,探讨在培养过程中hESCs的SNP、CNV、LOH和甲基化的动态变化。方法：1.玻璃化冷冻复苏Zhl-P16和Zh21-P17,在混合饲养层MMC上长期传代培养,每5-7天用机械法传代。2.分别提取Zhl系P20/P27和Zh21系P27/P60/P68代的基因组DNA,行高分辨率的114万SNPs位点Illumina Human omnil-quad beadchip基因分型芯片检测,分析SNP、CNV、LOH的变化。3.利用上述样品DNA进行Infinium HumanMethylation27BeadChip甲基化芯片检测,分析甲基化的变化。4.通过KEGG代谢通路数据库(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)分析CNV和甲基化的相关基因通路及基因的功能。结果：1.Zh1-P20、Zh1-P27G-显带核型分析为46,XX,FISH分析为二倍体46,XX；Zh21-P27、Zh21-P60和Zh21-P68G-显带核型分析为46,XY,FISH分析为二倍体46,XY。2.早期传代数Zhl P20->27的SNP变异率为4.01×10-6,早晚期传代数Zh21P27->60的SNP变异率为1.46×10-5,后者高于前者。3.Zh21-P27全基因组CNV的缺失比例为99.38%,扩增比例为0.62%；Zh1-P20缺失比例为96.77%,扩增比例为3.23%；与千人基因组计划中国北京汉族人(The Han People In Beijing Of China, CHB)(91.20%,8.80%)相比无统计学差异。4.在Zh21-P60/27中筛选出>0.5kb的5个CNV,在Zh21一P68/60晚期代数,共有10个>1MB的CNVS。CNV相关基因通路分析：涉及到三个基因的代谢通路,GABRG1、NEGR1和FOLZH1。5.hESCs长期培养中,Zh21的P27/60有25个大于1Mb的LOH变异,同一个系的P60/68有13个LOH变异。在Zhl-P20/27,3q26.1有一个1.48Mb的LOH。6.(?)hESCs长期培养过程中甲基化的分析,晚期代数Zh21P68相对于早期代数Zh21P27,高甲基化位点有196个,低甲基化的位点有91个。7.甲基化显著性差异基因分析：晚期代数Zh21P68与早期代数Zh21P27比较共有10个显著性差异基因,主要和丝裂原激活的蛋白激酶信号通路相关。结论：1.长期传代培养过程中hESCs存在SNP、CNV和LOH的动态变化,在早期传代过程中hESCs能够保持基因组稳定性,随着传代次数的增加,基因组的不稳定性也逐渐增强。2.临床应用之前,核型稳定的hESCs在传代过程中也应该间隔合适的传代代数用高分辨率的方法监测基因组的染色体特征。3.hESCs长期培养过程中晚期代数的细胞中高甲基化位点增多。4.分析遗传变异相关基因的通路,有助于理解变异基因的生物学功能。第三部分不同传代数的人胚胎干细胞神经诱导分化的遗传变异研究目的：探讨体外神经诱导分化过程对基因组变异CNV的影响,为今后细胞移植的安全性提供实验数据和理论基础。方法：1.体外通过拟胚体途径将hESCs定向分化为神经球和神经前体细胞,光镜观察神经诱导分化细胞形态。2.免疫荧光检测神经球标志物Nestin和神经前体细胞的特异性标志物Nestin和Map2。3.提取神经球的基因组DNA,通过Infinium HighDensity Human CytoSNP-12DNA BeadChip芯片检测诱导分化后的神经前体细胞的遗传变异(CNV和LOH)。结果：1.光镜下MMC饲养层上hESCs细胞呈克隆样巢状生长,经过EB培养基诱导培养后,克隆团块变为球形悬浮在培养液中,经过神经诱导培养基和神经球培养基诱导后,形成神经球,贴壁分化的细胞逐渐向神经细胞样改变形态,呈双极或多极并有分枝样突出或者突触。2.分化后期贴壁分化的细胞Nestin和Map2免疫荧光染色阳性,呈现神经前体细胞特征。3.神经诱导分化前后,Zhl早期代数稳定存在9p21.1的杂合性缺失和10p12.31的单拷贝增加,诱导后神经球中CNV长度分别增加0.01和0.02Mb,涉及相同的基因。4.N021P41神经球出现13q13.2-q13.3长度为0.63Mb的缺失,涉及到3个基因NBEA、MAB21L1和MIR548F5。N021p71神经球出现20q11.21长度为0.75Mb的扩增,涉及到14个基因DEFB115-124、REM1、NCRNA00028、HM13. PSIMCT-1、ID1、COX4I2、BCL2L1、TPX2、MYLK2、FOXS1、TTLL9、PDRG1和XKR7。5.Zh1系P37克隆、P27、P32、P33、P34、P38、P42、P44和P49神经球共9个样品均有Xp11.21一p11.1上3.2Mb的LOH；Zh21系P17、P41克隆与P41、P71神经球共4个样品均有1lp11.2-p11.12上3.6Mb的LOH。结论：1.体外经EB途径成功将Zhl和Zh21hESCs定向分化为神经球和神经前体细胞。2.诱导分化过程中的CNV可以由hESCs继承而来,虽然CNV相关基因不变,但长度会发生微小变化,早期代数会略有增加,而晚期代数呈现动态变化。3.神经诱导分化过程会产生新的CNV,晚期代数的细胞出现适应性生长。4.不仅需要严密监测传代培养的hESCs,也要监测相应传代数hESCs神经诱导分化的细胞,探索分化细胞的遗传特征,确保移植细胞的遗传安全性。