论文部分内容阅读
纤维二糖差向异构酶(CE,EC 5.1.3.11)与N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE,EC 5.1.3.8)、醛糖-酮糖结构异构酶Yih S和甘露糖结构异构酶(MI,EC 5.3.1.7)统称为AGE家族酶。大部分的CE仅表现差向异构活性,催化β1,4糖苷键连接的二糖的还原端葡萄糖基与甘露糖基间的相互转化。而来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus(CsCE)、Dictyoglomusturgidum(DtCE)和Spirochaeta thermophile(StCE)的CE,则表现出结构异构和差向异构的双催化特性,在催化二糖还原端甘露糖基和葡萄糖基相互转化的同时,结构异构催化果糖基的生成,这为高价值益生元依匹乳糖和乳果糖的生产提供了新的绿色合成途径。由于缺乏酶与结构异构产物的晶体结构,CE的结构异构催化机制尚属于猜测阶段,而影响其催化方向的决定因素亦不明确。本文通过解析CE及CE-结构异构底物晶体结构、理性设计、NMR质子传递追踪和QM/MM模拟等,深入研究了CE的差向异构和结构异构催化机制;结合对CE特征结构的重组和柔性环氨基酸突变研究,探讨影响CE差向异构和结构异构催化方向的关键因素,具体研究内容如下:首先,通过X-衍射获得了具有差向异构活性的BtCE和双催化特性的StCE的晶体结构,结合结构比对初步探讨酶催化特性与结构的相关性。BtCE和StCE分辨率分别为1.80和2.05(?),均具有AGE家族酶特有的(α/α)6桶状结构和催化中心。而对应于StCE_Trp380的色氨酸为CE特有,推测其与CE的二糖特异性识别有关。CE、Yih S和MI在活性中心外侧分别拥有一段由30个氨基酸构成的柔性环,其构象、形态及氨基酸组成差异较大,因此猜测柔性环的形状和氨基酸组成差异可能与酶的差向异构和结构异构催化特性有关。由于缺乏酶与结构异构产物的晶体结构,CE的结构异构催化机制尚不明确。为解析酶的结构异构催化机制提供结构基础,通过共结晶法首次获得CsCE与结构异构产物葡萄糖基-β1,4-D-果糖(Glc-Fru)的晶体结构。研究发现:底物Glc-Fru的非还原端葡萄糖基存在两种构象,一种构象与已报道葡糖基相同,另一种构象为CsCE特有,沿二糖的β1,4糖苷键旋转180°,此结构可能与CsCE的结构异构催化特性有关。结合底物前后,CsCE的(α/α)6桶状结构无明显变化。而柔性环(loop148-181)的形状、侧链氨基酸构象及分子间作用均出现重构:柔性环向活性中心移动,Ser173与Thr179等形成新的H键网。结合RmCE、Se Yih S和CsCE底物结合前后的柔性环的构象研究,发现具有结构异构活性的蛋白酶在结合底物后柔性环均具有重构现象,表明柔性环与酶催化特性具有潜在相关性。基于上述蛋白结构解析及差异分析,通过蛋白重组和定点突变,对推测的关键位点进行了分子改造,验证了Trp372及活性入口处柔性环对CE酶催化特性的影响作用。在蛋白重组研究中,以甘露糖结构异构酶(MI)为基础,引入CsCE的特征柔性环loop148-181和色氨酸CsCE_Trp372,构建重组酶CMW,深入探讨影响CE结构异构与差向异构催化方向的关键因素。重组酶CMW失去对单糖的识别和结构异构催化能力,而对二糖(乳糖)表现一定的差向异构催化活性(20.06 U/mg)和结构异构催化(0.27U/mg),CMW由MI变为普通CE。经对比发现CE的差向异构催化与其特有的CsCE_Trp372直接相关,CsCE_Trp372和CsCE_308构成的的“双色氨酸”结构将底物的构象限制为有利于差向异构的构象,使CE均表现出明显的差向异构催化;而CE参差不齐的结构异构催化可能是不同的柔性环对底物构象微调的结果。在分子模拟中,引入CsCE_Trp372后,Mm MI与二糖结合的熵、焓和结合自由能均大大降低,印证了CsCE_Trp372对二糖特异性识别的关键作用。为研究柔性环的氨基酸组成对CE差向异构和结构异构催化特性的影响,通过定点突变,构建10个柔性环突变体。突变体均表现与CsCE相当的差向异构活性(43U/mg),而结构异构活性差异明显。其中R170AF171A、N175K、N175RG176D和G176K仅保留15%左右的结构异构活性,而V177D和I178D突变体的结构异构活性显著提高,分别达到CsCE的1.5和1.8倍,证明了柔性环氨基酸的组成很大程度上影响酶的结构异构催化。Val177和Ile178位点突变为天冬氨酸可增强Ser173与周围氨基酸的盐桥和H键作用,使柔性环的形状更倾向于CsCE_Glc-Fru结构中的构象,提高酶的结构异构催化活性。经柔性环序列比对,发现在对应CsCE_R170-N175的氨基酸为长链带电氨基酸时,不利于酶的结构异构催化。为捕捉CE催化的中间产物,明确CE的催化步骤,课题构建了低催化活性的CsCE突变体H247F,并以高识别、低催化特性的底物甘露糖作为配体,筛选和解析H247F的复合晶体结构。分别获得了H247F与环形底物甘露糖和中间产物线性甘露糖的晶体结构,分辨率分别为1.70(?)和1.95(?)。底物线性甘露糖的捕捉第一次实验证明了CE催化的第一步和最后一步分别为开环和闭环反应。结合底物与活性中心氨基酸的位置,提出CE对二糖还原端糖基的开闭环机制:当底物还原端为吡喃环时,His377通过质子化和去质子化O5和O1独立催化吡喃糖基的开环和闭环。而当底物还原端为呋喃糖基时,His188与His377共同参与O5和O2的质子化和去质子化,达到开环和闭环的目的。此外,甘露糖在活性中心的构象为非催化构象,说明His247突变为苯丙氨酸不利于底物在活性中心的正确伸展,侧面证明了His247对底物构象的正确引导作用。最后,通过追踪CsCE和MI在重水缓冲液中催化H原子的传递,结合QM/MM模拟,确认催化的必需氨基酸和催化路径,深入研究了CE差向异构和结构异构催化机制。通过LC-MS和NMR检测,CsCE和MI的差向异构和结构异构催化均与缓冲液发生质子交换,实验证明了结构和差向异构催化机制均为烯二醇(cis-enediol)中间体机制。通过分子模拟和QM/MM模拟,发现His247和Glu250在催化中存在互补协同作用,因此将CE普遍认定的“三组氨酸”催化口袋修正为“三组氨酸-谷氨酸”口袋。并以此提出其差向异构和结构异构催化机制:(1)甘露糖基与葡萄糖基的差向异构催化中,His377和His247/Glu250分别作为酸/碱催化剂,摄取C2位的质子,催化形成cis-enediol中间体结构,并从另一侧提供质子,完成葡萄糖基和甘露糖基的相互转化;(2)结构异构反应由His377和His188共同催化完成,其中His188通过对C1和C2位羟基和羰基的去质子化和质子化,实现-O-C1=C2-OH和HO-C1=C2-O-两种cis-enediol中间体的相互转化,完成羰基在的转移,His377则催化C1的质子化和去质子化,完成吡喃糖基和果糖基的相互转化。