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背 景随着社会经济的快速发展和人们日常体力活动日趋减少的生活方式流行,肥胖及其相关疾病如心血管疾病、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病等患病率逐年攀升,并已成为当前威胁人类健康的全球性重大公共卫生问题。能量摄入和能量消耗的失衡是导致肥胖的根本原因,因而运动可通过增加机体能量消耗进而起到预防和控制肥胖的作用。关于运动防治肥胖的作用机制,目前认为至少有两个方面:其一是运动过程中由于肌肉做功增加进而导致机体消耗更多的能量,其二是长期坚持规律性运动特别是耐力运动可以诱导骨骼肌和脂肪组织产生一系列的适应性变化,如骨骼肌肌纤维类型转化、棕色脂肪激活、白色脂肪棕色化等,从而增加机体的基础代谢能量消耗。虽然耐力运动是一种有效而健康的肥胖防治手段,但由于工作繁忙、身体活动受限等诸多因素导致很多人都不能坚持规律性的运动锻炼,因而寻找能模拟或增强耐力运动诱导骨骼肌和脂肪组织适应的干预措施在肥胖防治中具有重要的应用前景。业已证实腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是介导耐力运动诱导骨骼肌和脂肪组织适应的关键信号分子,因而AMPK可作为研发耐力运动模拟剂或增强剂的干预分子靶点。近年来,具有激活AMPK活性效应的天然产物,特别是食物来源的生物活性成分如白藜芦醇、(-)-表儿茶素和姜黄素等对人体的健康保护效应备受关注。越来越多的研究证据表明,白藜芦醇具有防止肥胖、保护心血管、抗衰老等诸多健康保护作用,但口服生物利用率低是制约白藜芦醇实际应用的主要问题。紫檀芪(pterostilbene,PST)是天然存在的白藜芦醇二甲基衍生物,主要存在于紫檀以及蓝莓、葡萄等浆果中,具有许多与白藜芦醇相似的药理学活性,如镇痛、抗老化、消炎、抗糖尿病、抗肥胖、降胆固醇等,但其生物学活性、口服生物利用率和稳定性都要优于白藜芦醇。因此,紫檀芪的潜在应用价值较白藜芦醇更受青睐,但是迄今尚未见有紫檀芪作为耐力运动的模拟剂或增强剂的相关研究报道。目 的观察紫檀芪单独或联合耐力运动干预对大鼠骨骼肌和脂肪组织适应的影响,并探讨其中的可能作用机制,以期证实紫檀芪作为耐力运动模拟剂或增强剂的生物学效应,为紫檀芪应用于增强耐力运动表现、肥胖及其相关疾病的防治提供实验证据。方 法1.体内实验研究:24只8周龄雄性SD大鼠采用随机数字表法分为4组:安静对照组(SED)、PST(50 mg/kg体质量)干预组(PST)、耐力运动组(EX)、耐力运动+PST干预组(EX+PST),干预时间为4周。检测大鼠进食量、体质量、比目鱼肌(soleus,SOL)重量、腹股沟白色脂肪组织(Inguinal white adipose tissue,iWAT)重量;免疫荧光染色观察SOL中肌纤维截面积和组成类型,以及毛细血管数量的变化;H&E染色观察iWAT的形态学特征变化;实时定量聚合酶链反应分析(quantitative real-time polymerase chain reaction assay,qRT-PCR)和 Western blot检测SOL 中肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)基因亚型和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),以及iWAT中白色脂肪棕色化的一些标志基因、棕色化相关调控信号分子的表达情况;qRT-PCR 检测 SOL 和 iWAT 中线粒体 DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)含量。2.体外实验研究:小鼠C2C12成肌细胞和3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化成熟过程中给予PST干预处理。免疫荧光染色观察C2C12肌管细胞中的肌纤维组成类型变化,油红O染色观察3T3-L1脂肪细胞中脂滴形成;qRT-PCR和Western blot检测C2C12肌管细胞中MyHC亚型、VEGF的表达情况,并利用C2C12肌管细胞条件培养基共培养小鼠SEVC4-10血管内皮细胞检测血管生成情况;Western blot检测3T3-L1脂肪细胞中白色脂肪棕色化的一些标志基因、棕色化相关调控信号分子的表达情况;qRT-PCR检测C2C12肌管细胞和3T3-L1脂肪细胞中线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)含量;Seahorse细胞能量代谢仪检测C2C12肌管细胞;利用Compound C抑制AMPK活性或小干扰 RNA(Small interfering RNA,siRNA)敲低 PGC-1α 表达后,Western blot 检测脂肪细胞棕色化标志基因的表达变化。结 果1.PST组、EX组、PST+EX组与SED组比较,进食量无明显差异(P>0.05),但体质量增加明显降低(P<0.05)。2.实验各组间大鼠SOL的质量和截面积大小均无明显差异(P>0.05);免疫荧光染色结果显示:PST组较SED组大鼠SOL中慢肌纤维(绿色荧光)略有增加,但无统计学差异(P>0.05);EX组较SED组慢肌纤维比例明显增加(P<0.05),快肌纤维(红色荧光)比例相应显著降低(P<0.05);PST+EX组与EX组比较,慢肌纤维比例更高(P<0.05)。qRT-PCR 和 Western blot 检测结果显示:EX 组较 SED 组大鼠 SOL 中 MyHC-Ⅰ表达水平明显增加(P<0.05),与之相应的是MyHC-Ⅱ表达水平显著降低(P<0.05);PST+EX组与EX组比较,SOL中MyHC-Ⅰ表达水平进一步显著增加(P<0.05)。慢肌纤维较快肌纤维的血管和线粒体数量更多,EX组较SED组大鼠SOL中毛细血管与肌纤维比值(capillary/fiber ration,CFR)、毛细血管密度(capillary density,CD)明显增加(P<0.05),促血管生成因子VEGF表达显著上升(P<0.05),反映线粒体数量的mtDNA含量明显升高(P<0.05);与EX组比较,上述运动诱导的变化在PST+EX组中更为显著(P<0.05)。以上结果提示PST本身对骨骼肌纤维的组成类型无明显影响,但可显著促进耐力运动诱导的骨骼肌适应。3.体外实验结果显示:PST处理的C2C12肌管细胞较对照细胞MyHC-Ⅱ表达水平明显下降(P<0.05),MyHC-Ⅰ和VEGF表达水平显著上升(P<0.05),mtDNA含量也明显增加(P<0.05);PST处理的C2C12肌管细胞条件培养基较对照细胞条件培养基促进SEVC4-10细胞形成血管的作用明显;PST处理的C2C12肌管细胞的基础呼吸、最大呼吸、剩余呼吸功能和ATP产量均较对照细胞明显上升(P<0.05)。以上结果与动物实验研究结果保持一致。4.PST组、EX组、EX+PST组与SED组比较,iWAT指数明显降低(P<0.05),iWAT脂肪细胞变小、变圆并伴有多室细胞出现,呈棕色化特征;白色脂肪棕色化的标志基因和调控信号分子包括解偶联蛋白-1(uncoupling protein 1,UCP1)、诱导细胞死亡DNA 片断化因子 α 样效应因子 A(cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha-like effector A,CIDEA)、跨膜蛋白 26(transmembrane protein 26,TMEM26)、簇分化抗原 137(cluster of differentiation 137,CD 137)、肉碱棕榈酰转移酶 1A(carnitine palmitoyltransferase 1 A,CPT1 A)、细胞色素 c(cytochrome c,Cyto C)、过氧化物酶体增殖活化受体 γ 共激活因子 1α(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha,PGC-1α)和 PR 结构域蛋白 16(PR domain-containing 16,PRDM16)等 mRNA 表达水平显著增加(P<0.05),磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPKα)、UCP1、PRDM16蛋白水平明显升高(P<0.05);mtDNA含量明显上升(P<0.05)。且上述变化在EX+PST组中较PST组或EX组更为显著(P<0.05)。以上结果提示PST不仅可诱导大鼠iWAT发生棕色化,还可显著促进耐力运动诱导的iWAT棕色化。5.体外实验结果显示:PST处理的3T3-L1脂肪细胞中成脂分化标志分子包括过氧化酶活化增生受体 γ(peroxisome proliferators-activated receptor-gama,PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,C/EBPα)和脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding proteins 4,FABP4)等表达水平与对照细胞无明显差异(P>0.05),但 UCP1、p-AMPKα、PGC-1α、PRDM16 等表达水平显著升高(P<0.05),mtDNA 含量也明显增加(P<0.05)。此外,Compound C或PGC-1α siRNA预处理可明显降低PST诱导的UCP1、PRDM16等白色脂肪棕色化标志分子的表达水平增加(P<0.05)。以上结果提示PST可通过AMPK/PGC-1α通路诱导3T3-L1脂肪细胞发生棕色化。结 论1.PST和耐力运动均可明显降低大鼠体质量的增加,且这一控制体重增加的效应并非通过改变能量摄入(进食量)水平实现的,而是与能量消耗增加有关。此外,二者的联合干预效应显著优于单一因素干预。2.PST对大鼠骨骼肌肌纤维类型转化无明显影响,而耐力运动可明显促进以慢肌纤维比例、血管生成和线粒体数量增加为主要表现的肌纤维类型转化,且PST对耐力运动诱导骨骼肌肌纤维类型转化具有显著促进作用。3.PST可诱导大鼠iWAT发生棕色化,并对耐力运动诱导iWAT棕色化具有明显的促进作用,且AMPK/PGC-1α信号通路在其中扮演了重要角色。4.PST是一种耐力运动诱导骨骼肌和脂肪组织适应的模拟剂或增强剂,在增强耐力运动表现、防治肥胖及其相关疾病中具有潜在的应用价值。