【摘 要】
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禽类的性别决定以及性腺分化过程受到多种因子共同调控,研究较为深入的有具有剂量效应的睾丸决定因子DMRT1、卵巢发育相关的FOXL2等基因,但目前没有确切的启动禽类性别分化的因子。miRNA组织表达特异性有助于研究胚胎器官发育过程,目前发现多个miRNA在禽类性腺中呈现性别偏向表达,具有潜在调控禽类性腺分化的功能。课题组前期筛选了在鸡胚性腺等组织具有雄性偏好表达的miR-2954,并在支持细胞中验证
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禽类的性别决定以及性腺分化过程受到多种因子共同调控,研究较为深入的有具有剂量效应的睾丸决定因子DMRT1、卵巢发育相关的FOXL2等基因,但目前没有确切的启动禽类性别分化的因子。miRNA组织表达特异性有助于研究胚胎器官发育过程,目前发现多个miRNA在禽类性腺中呈现性别偏向表达,具有潜在调控禽类性腺分化的功能。课题组前期筛选了在鸡胚性腺等组织具有雄性偏好表达的miR-2954,并在支持细胞中验证miR-2954通过靶基因YY1及FOXD1调控雄性性别相关基因DMRT1和SOX9的表达。本研究在鸡胚胎中应用人工合成的miR-2954-VMO抑制miR-2954的表达,并通过芳香化酶抑制剂（AI）和雌二醇（E2）建立鸡胚性反转模型,以此探究鸡胚性腺中miR-2954对性分化相关基因表达和性腺发育的影响,为阐明miR-2954在鸡性别分化及性腺发育过程中的调控作用提供证据。本研究获得的主要结果如下:1.通过对比体外无壳培养以及开窗法培养过程中鸡胚的存活率,开窗法培养鸡胚在第15天后的存活率达52%,确认胚蛋开窗法对于后续研究比较有利。2.通过显微注射结合开窗法成功地将miR-2954-VMO导入鸡胚,在第10、12及18天三个时期的性腺和第12天的脑、肌肉及性腺三个组织中miR-2954的表达被显著抑制,建立了一种在鸡胚胎水平进行基因功能研究的可行性平台。3.通过切片HE染色、RT-qPCR和免疫荧光技术检测miR-2954-VMO处理后第10、12及18天鸡胚性腺的组织形态和性分化相关基因的表达。结果显示在雄性胚胎中miR-2954被抑制后,鸡胚性腺形态变化不明显,雄性性分化基因DMRT1、SOX9及AMH基因表达下调,而雌性基因CYP19A1和FOXL2表达趋势不明显;雄性性腺中DMRT1、SOX9蛋白表达减少而CYP19A1出现少量表达。结果表明了鸡胚中miR-2954可调控性腺分化相关基因DMRT1、SOX9和CYP19A1的表达。4.本研究分别使用芳香化酶抑制剂（AI）和雌二醇（E2）处理孵化第3天的鸡胚,通过切片HE染色、RT-qPCR和免疫荧光技术检测处理后第10天胚胎性腺的组织形态和性分化相关基因的表达,结果显示AI处理的雌性胚胎性腺呈对称分布与对照组雄性相似;雌性性分化基因CYP19A1和FOXL2表达显著下调而雄性性分化基因DMRT1以及SOX9表达显著上调;CYP19A1以及FOXL2蛋白表达减少而DMRT1和SOX9蛋白出现表达;E2处理的雄性胚胎中,右侧性腺退化变小,出现部分与雌性卵巢相似的组织形态结构;雄性性分化基因DMRT1和SOX9表达显著下调而雌性性分化基因CYP19A1和FXOL2表达显著上调。以上结果表明应用芳香化酶抑制剂和雌激素逆转了鸡胚胎的性腺性别。5.采用RT-qPCR技术检测AI和E2处理的鸡胚性腺中miR-2954的表达,结果显示AI处理雌胚性腺中miR-2954表达显著上调,而E2处理的雄胚性腺中miR-2954表达变化不显著。性反转鸡胚模型结果表明miR-2954的表达变化与雄性性分化基因DMRT1、SOX9的变化趋势一致,说明了miR-2954主要调节雄性睾丸的发育过程。以上结果表明miR-2954在禽类性别分化和性腺发育过程中起到一定的调控作用,其确切调控地位还有待于进一步研究。
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