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研究背景:咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma,CVA)是以慢性咳嗽为特征的哮喘亚型,可以被说话、灰尘及刺激性气味等因素诱发甚至加重,无喘息气短等呼吸道症状,但具有气道高反应性。现代医学主要通过吸入糖皮质激素、支气管扩张剂以及抗炎等治疗。但是部分病人治疗效果不佳,未能改善气道敏感性,长期咳嗽对CVA患者的工作与生活产生诸多影响,并加重患者的心理负担。导师苗青教授从事中医临床、教学以及科研工作多年,在CVA的中医药治疗方面经验丰富,总结出CVA以外感、内伤为要的证治理论,临床疗效显著。通过跟师学习,在导师的指导下,归纳总结导师从外感与内伤方面论治CVA的经验,并选取导师从外感论治CVA的常用处方(金沸止咳汤)进行动物实验探索,以瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)为切入点,深入研究CVA与TRPV1相关的机理,以及金沸止咳汤治疗CVA大鼠的疗效。第一部分 文献综述整理代表性古籍中对久咳久嗽理法方药的记载,融会贯通近现代中医名家治疗咳嗽、久咳嗽的思想经验,并将当代中医学家对CVA的认识与治疗归类为风咳、寒咳、燥咳、痰瘀咳嗽、肝咳、脾咳、肾咳进行论述。第二部分苗青教授论治咳嗽变异性哮喘经验总结目的:通过整理导师苗青教授从外感内伤角度治疗CVA的经验,深入领会导师从内外邪气辨治CVA的思路与方法。方法:通过跟随导师抄方学习、整理导师临床验案以及导师教学讲授,结合古籍探索及现代文献研究,总结导师从外感与内伤方面论治CVA的思路与方法,并附验案加以佐证。结果:导师认为CVA因于外感邪气者以风、寒、湿、燥之邪为主,CVA因于内伤者则以肝、脾、肾功能失调为主。外感六淫,感受风邪者,以疏风止咳为法,止嗽散加减;感受寒邪者,治以温润散寒止咳,金沸草散合止嗽散加减;感受湿邪者,治以化湿止咳,麻杏苡甘汤加味;感受燥邪者,治以疏风润燥止咳,清燥救肺汤、麦门冬汤为主方。内邪干肺,邪郁少阳,肝气犯肺者,治以疏肝止咳,小柴胡汤合止嗽散为用;脾虚及肺者,治以健脾化痰止咳,四君子汤加味;肾阳亏虚者,以温肾止咳为法,二仙汤加味。结论:导师苗青教授认为,CVA患者的辨治有外感与内伤之别,要关注患者的受邪途径,虽以散邪止咳为法,但有内外邪气之分。第三部分金沸止咳汤调控TRPV1的机理研究目的:通过金沸止咳汤调控TRPV1的动物实验,探索TRPV1在CVA发病中的机制,以及金沸止咳汤治疗CVA大鼠的疗效与机制。方法:根据随机法将126只健康雄性大鼠分为7组,即空白对照组、模型组、糖皮质激素组、中药低、中、高剂量组及TRPV1拮抗剂组。除空白组外,其余组参照文献方案建立大鼠CVA模型:第1天,每鼠以当日配制的卵蛋白氢氧化铝溶液,分别取10点(大鼠两后足跖、腹股沟、腰、背、颈部),每点皮下注射0.05ml,同时腹腔注射0.5ml,共计1ml;第8天重复上述操作,加强致敏;从第15天起,将大鼠置于自制透明雾化玻璃箱(50cm × 50cm × 30cm)内,每6只一组,给予1%(10mg/ml)卵蛋白溶液超声雾化激发20min,共10天,以激发CVA。TRPV1拮抗剂组在检测各项指标前3h、2h、1h,分别以10μmol/L的Capsazepine溶液雾化10min进行干预;其余给药组在末次卵蛋白溶液雾化激发后24h开始灌胃给药,连续28天。达到给药周期后,进行气道阻力检测,获得气道阻力值;之后获取大鼠血清及肺泡灌洗液,剪取大鼠主支气管及肺组织标本。各组大鼠以酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清及肺泡灌洗液中嗜酸性阳离子蛋白(eosinophilic cationic protein,ECP)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-5(interleukin-5,IL-5)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)含量;使用苏木精-伊红染色(hematoxylin eosin staining,HE染色)将大鼠气管及肺组织进行染色处理,显微镜下观察其病理形态学改变;蛋白印迹法(Western blot)检测各组大鼠TRPV1蛋白表达情况。结果:(1)大鼠主支气管及肺组织的病理学观察:空白对照组大鼠主支气管黏膜上皮连续完整,管壁及周围组织基本无炎症细胞浸润,管腔内基本无脱落细胞;镜下见肺组织中细支气管及肺泡结构清晰完整,观察细支气管黏膜上皮完整,基本无脱落细胞,管周无明显炎症细胞浸润。模型组大鼠主支气管黏膜上皮欠连续、不完整,支气管黏膜上皮脱落,管壁及周围组织炎症细胞浸润;细支气管管壁周围大量炎症细胞浸润,管腔内可见分泌物,肺泡间隔增宽,部分肺泡融合。各给药组大鼠主支气管黏膜上皮基本连续完整,支气管黏膜上皮脱落程度、管壁及周围组织炎症细胞浸润程度较模型组大鼠不同程度减轻;镜下见细支气管管腔结构较完整,肺泡结构较完整,与模型组相比,各给药组大鼠气道上皮脱落程度、炎症细胞浸润程度减轻。(2)各组大鼠行为学特征:空白对照组无特殊行为学异常;模型组大鼠在卵蛋白致敏后,出现呼吸较快,腹部四肢轻微抽动等行为;卵蛋白雾化激发后,出现呼吸加快、挠鼻、排尿排便等表现,随着卵蛋白雾化次数增加,大鼠精神状态逐渐变差,毛发逐渐蓬松,毛发光泽度逐渐降低,体重增长速度减缓或体重减轻;各给药治疗组大鼠服药后,一般状态较模型组有所好转。(3)各组大鼠气道阻力检测:生理盐水状态下:与空白组比较,模型组大鼠呼气相气道阻力升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠呼气相气道阻力降低(P<0.05)。静脉注射乙酰胆碱(0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.2mg/kg)状态下:与空白对照组比较,模型组大鼠呼气相阻力升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠呼气相气道阻力降低(P<0.05)。静脉注射乙酰胆碱(0.1mg/kg)状态下:与空白对照组比较,模型组大鼠呼气相气道阻力升高(P<0.05);与模型组比较,中药高剂量组、TRPV1拮抗剂组大鼠呼气相气道阻力降低(P<0.05),其余给药组大鼠呼气相气道阻力有降低趋势(P>0.05)。(4)大鼠血清ECP、IL-4、IL-5、TGF-β1含量:ECP:模型组大鼠血清ECP水平与空白组相比明显升高(P<0.01);各给药组血清ECP水平明显较模型组明显降低(P<0.01)。IL-4:模型组大鼠血清IL-4水平较空白组明显升高(P<0.01);与模型组比较,中药中剂量组、TRPV1拮抗剂组血清IL-4水平降低(P<0.05);其余给药组血清IL-4水平有降低趋势(P>0.05)。IL-5:模型组大鼠血清IL-5水平较空白组明显升高(P<0.01);各给药组血清IL-5水平较模型组明显降低(P<0.01)。TGF-β1:模型组大鼠血清TGF-β1水平较空白组明显升高(P<0.01);各给药组血清TGF-β1水平较模型组明显降低(P<0.01)。(5)大鼠肺泡灌洗液ECP、IL-4、IL-5、TGF-β1含量:ECP:与空白对照组比较,模型组大鼠肺泡灌洗液ECP水平升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠肺泡灌洗液ECP水平有下降趋势(P>0.05)。IL-4:与空白对照组比较,模型组大鼠肺泡灌洗液IL-4水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠肺泡灌洗液IL-4水平明显降低(P<0.01)。IL-5:与空白对照组比较,模型组大鼠肺泡灌洗液IL-5水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较,中药高剂量组大鼠肺泡灌洗液IL-5水平降低(P<0.05),其余给药组大鼠肺泡灌洗液IL-5水平明显降低(P<0.01)。TGF-β1:与空白对照组比较,模型组大鼠肺泡灌洗液TGF-β1水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,中药高、低剂量组大鼠肺泡灌洗液TGF-β1水平明显降低(P<0.01),糖皮质激素组、中药中剂量组、TRPV1拮抗剂组肺泡灌洗液TGF-β1水平降低(P<0.05)。(6)各组大鼠肺组织TRPV1表达:与空白对照组比较,模型组大鼠肺组织TRPV1蛋白表达呈增加趋势(P>0.05);与模型组比较,各给药组大鼠TRPV1蛋白表达呈不同程度减少趋势(P>0.05)。结论:(1)TRPV1的可能参与CVA的发生发展过程。(2)金沸止咳汤能够降低CVA大鼠气道阻力,改善气道高反应性。(3)金沸止咳汤可能通过下调CVA大鼠肺组织中TRPV1蛋白表达,减少ECP、IL-4、IL-5、TGF-β1含量,从而减轻气道慢性炎症。