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淋巴系统是循环系统的重要组成部分,由淋巴器官、淋巴管及其中的淋巴组成。淋巴管在维持体液平衡、运输免疫细胞、吸收膳食脂肪等生理过程中发挥了重要的作用。淋巴管的发育异常或功能紊乱会导致水肿、肥胖、高血压、炎性疾病与肿瘤转移等。淋巴管的功能如此重要,而当前对淋巴管发育的研究,尤其是对淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells,LEC)命运调控的研究仍处于起步阶段,进一步理解调控淋巴管发育的机制将有助于针对相关靶点开发新的临床治疗手段。我们利用模式生物斑马鱼(zebrafish)和原代人真皮淋巴管内皮细胞(HDLEC),分别从体内和体外两个方面研究了凝血酶受体PAR1/par1及其上下游分子对淋巴管发育的影响,提出了mmp13b/MMP1-par1/PAR1-gnai2a/GNAI2信号通路能通过影响淋巴管内皮细胞(LEC)标记因子prox1a/PROX1的表达而参与调控淋巴管发育过程。体外实验方面,我们主要通过向HDLEC中转染相关基因的siRNA,通过qPCR和Western blot检验其对PROX1的影响。体内实验方面,我们主要通过相关转基因斑马鱼系Tg(fli1:eGFP)和Tg(kdrl:GFP;prox1:RFP),使用 Morpholino 技术和CRIPSR/Cas9技术开展相关基因功能的研究,并结合整胚原位杂交、免疫荧光染色、激光共聚焦成像等检测手段对斑马鱼淋巴管发育情况进行观察与分析。本课题主要的研究内容和结论如下:一、par1/PAR1通过影响LEC标记因子proxla/PROX1参与调控淋巴管发育。我们通过qPCR和WB实验证实,向原代HDLEC中转染PAR1-siRNA能显著抑制PROX1的表达。在斑马鱼胚胎中,整胚原位杂交结果显示斑马鱼的par1于受精后24小时(24 hours post fertilization,24 hpf)在胚胎的后主静脉(PCV)中表达。激光共聚焦成像图片表明,受精后第5天(5 dpf)的斑马鱼par1-morphant和par1-mutant的主要淋巴管——胸导管(TD)均表现出明显的发育不良。我们利用Tg(karl:GFP,prox1:RFP)背景的斑马鱼par1-morphant观察到TD部位红色荧光表达显著下调,该结果与利用Tg(flil:eGFP)背景的斑马鱼par1-mutant中开展的Prox1免疫荧光实验结果相互印证,表明par1是通过影响prox1a的表达而调控淋巴管发育的。二、mmp13b/MMP1 是参与par1/PAR1调控淋巴管发育过程的上游因子。目前已知 PAR1 的上游蛋白酶有 TRY、F2、F10、GZMA、PLG、APC、MMP1、MMP13等,但我们通过qPCR实验发现HDLEC中PAR1的上游配体里仅MMP1显著高表达;且向HDLEC中转染MMP1-siRNA后PROX1的表达受到抑制。斑马鱼中没有mmp1基因,通过生物信息学分析预测斑马鱼mmp13b与人MMP1可能具有相似的功能;我们通过整胚原位杂交实验证实斑马鱼的mmp13b在24 hpf时表达于PCV,与par1的表达的位置一致。通过Par1主要上游配体凝血酶(Thrombin,F2)的Morpholino或抑制剂SCH79797处理后,斑马鱼胚胎的TD发育无明显异常,排除了 F2参与调控淋巴管发育的可能性;但在经过MMP13/MMPs抑制剂处理后,斑马鱼胚胎的TD均表现出与par1功能缺失时相似的异常表型,表明是mmp13b参与了调控斑马鱼淋巴管的发育。三、gnai2a/GNAI2作为下游因子参与了par1/PAR1 调控淋巴管发育的信号通路。PAR1是膜蛋白,主要通过胞内的G蛋白如GNA11、GNAQ、GNA12、GNA13、GNAI1、GNAI2和GNAI3等传递胞外信号;通过qPCR检测发现HDLEC中GNA11、GNA13、GNAI2的表达量相对较高,但在转染PAR1-siRNA 后,仅GNAI2的表达受到抑制;且当转染GNAI2-siRNA后,qPCR和WB的检测结果都表明HDLEC中PROX1的表达量下调。在斑马鱼中,整胚原位杂交实验结果表明gnai2a在24 hpf表达于PCV,与par1和mmp13b的表达位置一致。具有Tg(fli1:eGFP)背景的斑马鱼gnai2a-morphant和gnai2a-mutant在5 dpf时出现显著的TD缺失表型;对具有Tg(karl:GFP;prox1:RFP)背景的斑马鱼 gnai2a-morphant 的观察结果表明其 TD 部位红色荧光表达显著下调,表明是gnai2a通过影响prox1a参与了调控斑马鱼的淋巴管发育过程。综上所述,我们首次发现凝血酶受体Par1能调控斑马鱼淋巴管发育,并提出了 mmp13b/MMP1-par1/PAR1-gnai2a/GNAI2 信号通路是通过影响 LEC 命运决定和维持因子prox1a//PROX1的表达而参与调控淋巴管发育的。本课题中的体外和体内研究结果互相印证,加深了我们对LEC细胞命运调控机制的理解,丰富了我们对斑马鱼淋巴管发育调控机制的认识,也为以PAR1为靶点的临床药物治疗淋巴管相关疾病提供了新的理论基础。