本论文聚焦老药的二次研发,以上市抗真菌药物环吡酮胺和抗肿瘤药物quisinostat为先导化合物分别设计合成了一系列具有抗中风和抗疟疾活性的结构新颖的候选化合物,并系统研究了其活性、成药性和作用机制。此外,本论文还发现了基于姜黄素结构的极性荧光探针,可用于细胞成像以监测溶酶体内极性变化。论文由三部分组成:第一部分为N-羟基吡啶酮类抗脑卒中神经保护剂的设计合成与活性研究。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)加剧了缺血性中风(ischemic stroke)患者的脑组织损伤,而在溶栓后应用神经保护剂类药物可以缓解缺血再灌注损伤,促进神经功能的恢复。前期研究发现的先导化合物抗真菌上市药物环吡酮(ciclopirox,CPX)的神经保护活性不佳,并且代谢稳定性较差。因此,在本工作中,我们以环吡酮为先导化合物开展老药二次研发,旨在通过结构改造提高活性并改善药代动力学性质。我们对环吡酮进行结构修饰得到了N-羟基吡啶酮类衍生物A1-A31,并通过SH-SY5Y细胞构建的OGD(氧糖剥夺,oxygen-glucose deprivation)模型评价了这些衍生物的神经保护活性、血脑屏障透过性和氧自由基清除能力。衍生物A10的神经保护效果优于环吡酮且起效浓度更低,同时具有更强的氧自由基清除能力,其乙醇胺盐A10-Ola的水溶性优于环吡酮胺(CPX olamine),而其透血脑屏障能力与之相近,因此被确立为优选化合物。A10·Ola在神经细胞模型上具有缓解兴奋性毒性和氧自由基损伤以及抑制细胞凋亡的效果,并可以维持细胞结构完整。A10·Ola和环吡酮胺对hERG钾离子通道的抑制活性均较弱,然而两者具有相近的细胞毒性。在大鼠MCAO(脑中动脉栓塞,middle cerebral artery occlusion)模型上,0.3 mg/kg的A10·Ola减小梗死体积的药效与3 mg/kg的环吡酮胺相当,1 mg/kg 的 A10·Ola 对 mNSS(modified neurological severity scores,神经缺陷评分)评分的改善优于3 mg/kg的环吡酮胺的药效,而3 mg/kg是前期研究中确立的环吡酮胺的最优药效剂量。鉴于A10·Ola在动物实验中的药效剂量远低于环吡酮胺,且两者细胞毒性相近,A10·Ola具有相对更好的安全性。此外,A10·Ola的代谢稳定性优于环吡酮胺。我们设计合成了含有环吡酮结构的探针AP1-AP3用于靶标垂钓。其中,环吡酮的1位和3位直接连接linker-生物素片段得到的探针AP1和AP2无活性,而含有双吖丙啶和炔基的探针AP3具有较好的神经保护活性,有望通过光交联和click反应间接标记潜在的靶蛋白,但以AP3为探针的靶标垂钓实验没有成功。我们转而通过bSDTNBI(balanced substructure-drug-target network-based inference,平衡的基于化合物子结构-药物-靶点相互作用网络推理方法)和铁离子螯合实验研究发现A10和环吡酮可以通过铁离子螯合上调HIF-1α发挥神经保护活性,其氧自由基消除效果也有助于神经保护活性。在这部分工作中,我们设计合成了 31个N-羟基吡啶酮类衍生物,并系统研究了其体内外药效和成药性。从中发现了神经保护活性、抗氧化活性和代谢稳定性均优于环吡酮且血脑屏障透过性与之相当的优选化合物A10,其乙醇胺盐—A10·Ola在远低于环吡酮胺的剂量上就可以发挥更好的神经保护活性,鉴于两者细胞毒性相当,药效剂量更低的A10·Ola具有更好的安全性。本研究取得的成果有助于新型抗中风候选药物的开发。第二部分是酰肼类PfHDAC抑制剂的设计合成与活性研究。PfHDAC(P.falciparum histone deacetylase,恶性疟原虫组蛋白去乙酰化酶)抑制剂的作用机制与青蒿素不同,有望用于治疗青蒿素耐药疟疾。抗肿瘤HDAC抑制剂quisinostat具有很强的抗疟活性,但具有很强的细胞毒性和人源HDAC抑制活性,其结构可以分为嘧啶异羟肟酸(锌离子结合基团)、4-氨甲基哌啶(连接链)和N-甲基吲哚片段三部分。课题组前期研究维持异羟肟酸结构不变,对连接链和N-甲基吲哚片段进行了结构优化得到了一系列衍生物。虽然这些衍生物的细胞毒性大大降低,但是仍然有强烈的人源HDAC抑制活性、代谢稳定性差和口服生物利用度低等缺陷。鉴于PfHDAC和人源HDAC的活性中心(锌离子结合基团作用位点)之间存在结构差异,并且异羟肟酸中的羟基是主要的代谢位点,所以在本工作中,我们设计合成了一系列具有新型锌离子结合基团的PfHDAC抑制剂B1-B64,以期提高选择性并优化药代动力学性质。其中,B1-B9的锌离子结合基团为N-酰基邻苯二胺或其类似物,但其抗疟活性较差或完全丧失。为此,我们进一步合成了以酰基肼为锌离子结合基团的衍生物B10-B18,其中衍生物B11(其锌离子结合基团为N2-丙基—N1—嘧啶甲酰基肼)不仅抗疟活性好,而且细胞毒性低。与quisinostat相比,B11对于人源HDAC多个亚型的抑制活性都大幅下降。因此,N2—丙基-N1-嘧啶甲酰基肼被确立为具有更高种属选择性的新型HDAC抑制剂的锌离子结合基团。在此基础上,我们对B11中的4-氨甲基哌啶连接链和N-甲基吲哚进行结构改造得到了衍生物B20-B64。其中变换连接链得到的衍生物B19-B23的活性和选择性较之B11大幅下降。于是,我们维持4-氨甲基哌啶连接链不变,将N-甲基吲哚替换成其他取代基得到了衍生物B24-B64。其中,B32、B35和B36的抗疟活性有所提高,活性最优衍生物B36对Pf3D7虫株的IC50值在25 nM左右。B36具有更低的细胞毒性,其选择性指数SI293T/Pf3D7为63,优于quisinostat和B11。此外,B36对人源HDAC的抑制活性与quisinostat相比下降了约70倍,并且其盐酸盐B36·HCl具有比异羟肟酸类衍生物更高的口服生物利用度。在这部分工作中,我们设计合成了 64个具新型锌离子结合基团的PfHDAC抑制剂,并研究了其抗疟活性、细胞毒性、选择性和对于人源HDAC的抑制活性。其中的优选化合物B36的抗疟活性较好,细胞毒性低,对人源HDAC的抑制活性大幅下降,种属选择性大幅提高,并兼具更高的口服生物利用度,有望开发为新一代具有更高选择性且更加安全的口服抗疟药物。第三部分是基于姜黄素的比率型溶酶体极性荧光探针的发现和应用研究。多种生理和病理过程中都伴随着溶酶体极性变化,溶酶体靶向性极性敏感型荧光探针可以作为相关研究的有力工具。因此,在本工作中,我们以全新的结构设计策略开发了基于姜黄素的溶酶体靶向性比率型极性探针。虽然姜黄素类衍生物的发射波长较长,但姜黄素结构本身的水溶性差且易受所处环境干扰。为了克服这些缺点,我们对姜黄素进行结构改造得到了探针C1-C5。其中,含有二乙胺结构的探针C1和C2的极性敏感性优于含有半刚性结构(4-甲基哌嗪)或刚性结构(久洛尼定)的探针C4和C5,说明二乙胺片段可以提高极性敏感性。与C1和C2相比,不含糖的探针C3不溶于水且在混合溶剂中对于极性变化的响应也与前两者不同,说明半乳糖片段提高了水溶性并改变了极性响应模式。探针C1和C2的抗干扰能力强,pH和粘度的变化和常见的干扰物质对于两者荧光发射光谱的影响很小。探针C1和C2在两个波长之间的荧光强度比率(C1:I602/I554;C2:I606/I545)与极性参数△f(定向极化度)之间呈现良好的线性关系。两者光稳定性好,其光学性能可以对复杂环境中的极性变化进行特异性地精确地实时监测。我们以探针C2为例研究了这类探针的极性响应机制,通过对一维和二维核磁共振谱的解析发现探针C2在不同极性的溶剂中的两种互变异构体β-二酮式和酮-烯醇式的比例是不同,这可能是荧光随着极性变化的原因。探针C1的细胞毒性比探针C2更低,我们因此选择C1用于细胞成像实验。探针C1在不同的细胞中均具有较好的溶酶体靶向性,并可通过荧光成像中红通道和绿通道荧光强度的比值变化反映出不同细胞系的溶酶体极性差异,可用于检测多种细胞的溶酶体极性。在蔗糖模拟的溶酶体贮积症或二甲亚砜刺激造成的HepG2和293T细胞内溶酶体极性变化的过程中,探针C1的红通道和绿通道荧光强度的比值也发生了显著的变化,说明探针C1可以实时监测细胞内溶酶体极性变化。综上所述,溶酶体靶向性比率型极性荧光探针C1具有良好的极性敏感性、抗干扰能力、光稳定性、水溶性和生物相容性,有望用于研究与溶酶体极性变化相关的生物过程。