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背景:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是单股负链不分节段RNA(-ssRNA)病毒,属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属,是禽类烈性传染病新城疫的重要致病因子。新城疫(Newcastle disease,ND)是一种严重危害禽养殖业发展的病毒性传染病,禽感染后进展迅速,病死率高,主要表现为浆粘膜出血、下痢、呼吸困难、神经紊乱等系列症状。人感染NDV后症状轻微,表现为一过性的流感样或结膜炎症状。目前NDV疫苗尽管在一定程度上缓解了疫情的大规模发生,但随着各地变异株的不断出现,针对新城疫的防治工作也遇到了很大的挑战,其主要障碍在于NDV感染宿主细胞过程中病毒包膜和细胞膜融合机制尚不明确。NDV是副粘病毒典型代表,弄清NDV细胞融合机制不仅为研制特异性强的抗NDV药物提供理论基础,而且能为其他副粘病毒融合机制研究提供一定参考。细胞融合是NDV侵入细胞和增殖的关键,也是其感染宿主细胞的典型病变特征。NDV引起的膜融合需要同源的血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(fusionprotein,F)协同表达完成,说明HN和F蛋白之间必定存在着某种信号交流或相互作用。大多数研究认为,HN头部与唾液酸受体结合后,激活信号产生并转导至HN和F相互作用区,通过促进F蛋白裂解和构象变化,激活F蛋白,导致细胞融合。WelchBD根据NDV两种膜蛋白X射线晶体结构,提出了同源四聚体上抬(4-heads up)和下垂两种结构模型(4-heads down),即HN结合唾液酸受体前,HN头部保持自然下垂状态,下垂的球状头部阻碍了颈部中上段(49-78)残基与F蛋白的相互作用;当HN蛋白头部与唾液酸受体结合后,球状头部受到激活上抬,暴露了 HN中上段氨基酸残基与F蛋白相互作用区,激活F蛋白。这里HN头部构象转换涉及到两个4HB颈部相互作用区,一个是HN颈部与F蛋白的相互作用区(49-78),该区直接参与F蛋白的激活;另外一个是HN颈部与头部的相互作用区(91-112),其在维持头部模型的正常转换中发挥重要作用。目前,颈部区域研究主要集中在HN颈部与F蛋白的相互作用区,对于HN头颈部相互作用区的研究仍未见报道。本研究以NDVHN作为研究对象,通过比对NDVHN(91-112)氨基酸序列与 hPIV3HN、MeVH、RSV G氨基酸序列,确定 hPIV3HN、MeVH、RSVG相似位置的基因序列,构建NDV HN(91-112)aa缺失突变体和嵌合体。通过检测突变体HN蛋白的活性和功能改变,进一步理解NDV HN(91-112)aa区域的生物学功能和促细胞融合的可能机制。目的:研究NDV HN蛋白头颈部相互作用区片段突变对HN蛋白生物学活性与促细胞融合功能的影响,探讨头颈部相互作用区影响膜融合的机制,为研发安全高效的抗NDV药物进行新城疫防控以及构建重组肿瘤疫苗进行肿瘤治疗提供理论依据。方法:1.突变体的构建:比对NDVHN(91-112)氨基酸序列与hPIV3HN、MeV H、RSV G氨基酸序列,确定hPIV3 HN、MeV H、RSV G相似位置的基因序列。利用PCR片段突变和同源重组技术,构建缺失突变体De(HN)和嵌合体Ch(hPIV3),Ch(MeV),Ch(RSV)。2.NDV HN突变体蛋白的表达:利用阳离子脂质体转染试剂ExFect2000将突变的HN质粒和野生型F质粒共同转入BHK-21真核细胞,通过vTF7-3重组痘苗病毒瞬时蛋白表达系统进行表达。3.NDVHN突变体蛋白表达情况检测:利用间接免疫荧光(IIFA)检测突变体蛋白的定性表达情况;利用流式细胞术(FCM)检测突变体蛋白在细胞膜表面的表达效率。4.NDV HN突变体蛋白功能检测:Giemsa染色观察合胞体形成和指示基因法分别定性定量检测突变体蛋白的促细胞融合活性;染料转移法(R18荧光探针)用于HN突变体蛋白的半融合活性的测定;红细胞吸附试验用于突变体蛋白的受体结合活性的测定;酶催化荧光法用于突变体蛋白的神经氨酸酶活性的测定。5.统计学方法:采用SPSS21.0软件进行统计学分析。突变体HN蛋白和野生型HN蛋白功能检测结果以x±s形式表示,采用r检验比较,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.DNA测序结果显示,NDVHN91-112aa成功进行了缺失和置换,缺失突变体 De(HN)和嵌合体 Ch(hPIV3),Ch(MeV),Ch(RSV)构建成功。2.突变体蛋白De(HN)、Ch(hPIV3)、Ch(MeV)、Ch(RSV)的促细胞融合活性分别为野生型的 3.83%、57.84%、24.76%和 29.42%(P 均<0.05),其中 De(HN)的促细胞融合活性基本消失,镜下未见合胞体形成。3.突变体蛋白 De(HN)、Ch(hPIV3)、Ch(MeV)、Ch(RSV)的受体结合(HAD)活性分别为野生型的13.48%、65.22%、36.25%和34.93%(P均<0.05),与各突变体的促细胞融合活性变化具有较强的一致性。4.突变体蛋白De(HN)、Ch(hPIV3)、Ch(MeV)、Ch(RSV)的神经氨酸酶(NA)活性分别为野生型的 10.81%、60.35%、54.42%和 50.13%(P 均<0.05)。5.突变体蛋白De(HN)、Ch(hPIV3)、Ch(MeV)、Ch(RSV)的半融合活性不同程度下降,其中Ch(hPIV3)半融合活性较其他突变体高,Ch(MeV)、Ch(RSV)的半融合活性次之,De(HN)的半融合活性基本消失。6.突变体蛋白Ch(hPIV3)、Ch(MeV)、Ch(RSV)的细胞表面表达水平分别为野生型的75.65%、82.20%和70.16%(P均>0.05),De(HN)的细胞表面表达水平严重下降,为野生型的9.04%(P<0.01)。结论:1.NDV HN 91-112头颈部相互作用区对于吸附蛋白的受体识别和促细胞融合功能具有重要意义。2.缺失突变体De(HN)促细胞融合活性的丧失与蛋白未能在细胞表面表达有关,嵌合体促细胞融合活性的下降受蛋白表达水平影响不大。3.各自的促细胞融合活性变化与突变体蛋白HAD活性的降低具有较强的一致性,NA活性的改变与突变体的促细胞融合活性也呈近似正向关系。4.嵌合体蛋白HAD和NA活性下降可能使HN头部在结合和清除唾液酸受体的过程中传导信号发生衰减,不能充分激活F蛋白和细胞融合。