背景临床研究发现某些患者接受储存时间较长的（陈旧）血小板输注时发生血栓栓塞、炎症等不良反应的风险增加。而体外实验发现在陈旧血小板中细胞外囊泡发生累积且具有促凝、促炎、免疫调节等活性。血小板细胞外囊泡可能是输血不良反应发生发展的影响因素。外泌体与微囊泡是血小板细胞外囊泡主要成分,由于分离技术发展的限制,一直以来二者的功能影响都未被明确探究,研究者们更多的是探究血小板细胞外囊泡在生理病理状态下的表达情况及可能的影响机制。近年来,外泌体与微囊泡的分离与鉴定技术得到了较大的发展,研究者们开始关注血小板微囊泡的体内体外促凝、促炎等作用,而对于储存导致血小板分泌的外泌体中生物活性物质的变化以及外泌体与临床输血后凝血功能的关系尚无相关报道。血小板外泌体携带并富集蛋白质、脂质、核酸等生物活性物质,蛋白质的作用尤为重要,外泌体可通过富集的蛋白与体内多种靶细胞作用,直接或间接参与多种生理病理过程。因此,本研究将筛查储存期间血小板中外泌体蛋白质的表达差异,从蛋白层面分析外泌体与各种临床输血不良反应的相关性。同时,通过体外实验探究不同储存时间血小板外泌体对凝血功能的影响,进一步获得外泌体影响凝血的可能机制。目的1.分析储存期间血小板外泌体蛋白表达谱,获得储存导致的血小板外泌体中差异蛋白,通过生物信息学分析获得差异蛋白富集通路的种类,为陈旧血小板与输血不良反应的相关性打下基础;2.分析储存期间的血小板外泌体含量变化及其对凝血功能的影响,初步获得外泌体影响凝血功能的可能途径。同时,对相关差异蛋白进行验证,为研究血小板储存过程中产生的外泌体对凝血功能的影响机制以及进一步研究预防血栓等输血不良反应提供了理论基础。方法1.提取并筛查不同储存时间血小板外泌体蛋白质的表达差异使用超速离心法提取不同储存时间（0天、5天）血小板中外泌体,并采用蛋白免疫印迹法（Western blot）、透射电子显微镜法及纳米流式技术鉴定所提取的外泌体。利用Label free相对定量蛋白组学技术检测3份储存0天与5天血小板样本的外泌体蛋白质表达谱并对蛋白进行表达差异分析,通过生物信息学分析获得差异蛋白功能富集通路。2.不同储存时间血小板外泌体的含量变化及其对凝血功能的影响采用纳米流式仪对10份不同储存时间（0天、3天、5天）血小板中外泌体浓度进行检测。将10份0天与5天血小板外泌体、PBS分别与新鲜血浆室温下孵育30min后,使用全自动凝血分析仪检测各样本的凝血酶原时间（PT）值、活化部分凝血活酶时间（APTT）值。将5份0天与5天血小板外泌体、PBS分别与新鲜全血室温下孵育1h后,使用血栓弹力图仪检测各样本的血凝时间（R）、血凝速率（α角）、血块形成时间（K）、血块强度（MA）、血凝综合指数（Cl）。通过Western blot实验及Image J软件对5份不同储存时间（0天、5天）血小板外泌体中凝血因子VII的含量进行半定量测定。结果1.提取并筛查不同储存时间血小板外泌体蛋白质的表达差异1.1外泌体鉴定鉴定实验结果显示所提囊泡表达外泌体特异性蛋白标志物TSG 101、CD 9;其电镜下观察为有膜、杯状形态;其粒径多分布于60~80nm。均符合外泌体表征。1.2蛋白质表达谱及生物信息学分析5天与0天外泌体蛋白表达差异分析结果显示,有89个蛋白在两组表达存在差异且在储存5天外泌体样本中表达量增加,其中增高倍数大于10倍的差异蛋白共1个,为神经胶质源性连接蛋白。增高倍数大于5倍以上的差异蛋白有10个,依次为反式甲精酸-2、潜在转化生长因子结合蛋白-1、转化生长因子β-1前蛋白、粘附分子A、WD重复蛋白1、抑菌素、Ras相关蛋白1B、ADP-核糖基化因子1、跨膜蛋白33、补体衰减加速因子。增高倍数大于2倍的差异蛋白共43个。对所有表达量增加的蛋白质进行生物信息学分析,结果显示差异蛋白主要参与大肠杆菌感染通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、沙门菌感染通路、Rap1信号通路、癌症通路、血小板活化通路。其中大肠杆菌感染通路、沙门菌感染通路与炎症反应相关;差异蛋白富集的肌动蛋白细胞骨架调节通路、Rap1信号通路与凝血作用相关。此外,差异表达分析显示凝血因子VII表达量增加3倍以上。2.不同储存时间血小板外泌体的含量变化及其对凝血功能的影响2.1不同储存时间血小板外泌体浓度变化血小板储存0、3、5天外泌体颗粒浓度分别为（13.86±7.93）×1012、（23.69±12.80）×1012、（45.81±25.87）×1012个/L。与储存0天相比,储存3天血小板外泌体浓度增加了1.8倍（P＜0.01）,储存5天外泌体的颗粒浓度增加了4.0倍（P＜0.01）。储存5天血小板外泌体浓度约为储存3天的2.2倍（P＜0.05）,即储存时间延长,血小板中外泌体含量增加。2.2不同储存时间血小板外泌体对凝血功能的影响2.2.1不同储存时间血小板外泌体对PT、APTT的影响PBS、0天与5天血小板外泌体样本分别与新鲜血浆孵育后结果显示,与对照组相比,储存0天与储存5天血小板外泌体分别可使PT减小[（0.16±0.15）s,P＜0.01]、[（0.36±0.18）s,P＜0.001];储存0天与5天血小板外泌体分别可使APTT减小[（1.11±1.21）s,P＜0.05]、[（2.10±1.14）s,P＜0.001]。即血小板储存期间产生的外泌体可影响血浆凝血功能。2.2.2不同储存时间血小板外泌体对全血凝血功能的影响PBS、0天、5天血小板外泌体凝血时间R值分别为（5.46±0.90）min、（5.00±0.67）min、（4.38±1.00）min,储存5天组R值与PBS组、0天组相比,差异具有显著性（P＜0.05）,提示外泌体具有一定的促凝作用。2.2.3不同储存时间血小板外泌体中凝血因子VII的表达对5份储存0天、5天血小板外泌体经蛋白裂解获得蛋白样本后,使用Western blot实验进行半定量分析凝血因子VII,结果显示与0天组相比,5天组外泌体中凝血因子VII含量增加1.4倍,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论1.蛋白组学分析显示不同储存时间血小板外泌体蛋白表达存在差异。生物信息学分析显示差异蛋白质可能通过肌动蛋白细胞骨架调节通路、Rap1信号通路参与凝血反应;通过大肠杆菌感染通路、沙门菌感染通路发挥促炎作用。推测陈旧血小板中外泌体可能影响炎症、凝血过程;2.随着血小板储存时间延长,外泌体含量增加,外泌体中凝血因子VII表达量也增加,可能是因子VII通过内、外源性凝血途径发挥促凝作用。陈旧血小板中外泌体可能是血栓等输血不良反应的影响因素。