高氧液抑制根管内常见致病菌的实验研究

来源 :中国人民解放军空军军医大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:liaozhouyi
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根管治疗术是临床治疗牙髓炎、根尖周炎等口腔感染性疾病最完善的治疗方法。厌氧菌为感染根管内的主要细菌,以专性厌氧菌为主,包括消化链球菌、类杆菌、真细菌、梭杆菌、丙酸杆菌、和放射菌等。研究表明,根尖周病的发生和发展与厌氧菌紧密相关。对感染根管内菌群的有效控制决定了根管治疗是否成功,而根管治疗(Root canal therapy,RCT)的关键点在于根管冲洗。目前1-3%过氧化氢液、0.5%次氯酸钠液以及生理盐水都是临床常用的根管冲洗液。但次氯酸钠存在味道刺鼻以及过氧化氢非常容易导致患者出现皮下气肿等诸多缺点限制了临床工作的开展。所以在临床工作中,找到一种高效、安全、成本低的冲洗剂,对提高口腔感染性疾病的治疗成功率十分重要。课题组前期工作中曾利用“快速气体置换溶氧”技术,发明了高氧医用液体治疗仪,能制备出氧分压为106.6±7.8 kPa的高氧液,氧浓度达到常规液体的5.3倍。针对根管内感染主要为厌氧菌的特点,我们拟用高氧液作为根管预备过程中的冲洗剂来探讨其抑菌效果。根据氧抑制机制,气态的氧并不能造成厌氧微生物的死亡。研究表明,某些氧代谢产物的毒性很大,厌氧微生物是因为不能降解其毒性而最终死亡。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)为自由基清除剂,因SOD的功能是保护好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害,故我们通过检测细菌SOD基因表达情况,明确高氧液抑菌作用的机制。另外,Caspase3被称为细胞程序性死亡的执行者,其结构、功能复杂,调控方式独特,决定着细胞的命运。我们采用Caspase3作为细菌程序性死亡的指示分子,通过检测Caspase3的表达,观察细菌程序性死亡情况,进一步明确高氧液抑菌作用的机制。最终我们结合临床,将高氧液应用于临床根管冲洗来探讨其能否抑制感染根管内的致病菌。试图为临床预防口腔感染性疾病提供一种操作简单、成本低廉、无毒副作用、有益健康的新方法。第一部分实验:高氧液对根管内常见致病菌的作用研究。目的:以感染根管内常见的三种厌氧菌(变形链球菌、黏性放线菌、中间普氏菌)作为研究对象,通过细菌学实验,明确高氧液对感染根管内常见三种致病菌的抑菌效果,并比较高氧液与常规冲洗液的抑菌效果的差异。方法:制备高氧液并复苏变形链球菌、黏性放线菌和中间普氏菌,培养细菌至指数生长期。进行高氧液抑菌实验,计数培养基上存活菌落数,并通过游标卡尺测量抑菌圈的直径,比较高氧液对三种常见根管内感染细菌的抑菌效果。采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。用Student’s t-test方法检验高氧液对同一种根管内常见感染细菌的抑菌圈直径大小进行比较。用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey HSD检验比较高氧液对不同常见根管内细菌抑菌圈直径大小。P<0.05设置为有统计学差异,实验重复三次。结果:本实验成功制备出符合标准的稳定的高氧液并成功培养变形链球菌、黏性放线菌和中间普氏菌。使用高氧液、0.5%次氯酸钠溶液和0.9%氯化钠溶液分别处理三种细菌,计数培养基上存活菌落数,实验结果显示:与0.9%氯化钠溶液组(1197.2±153.4)相比,高氧液处理组(818.7±121.4)和0.5%次氯酸钠溶液组(403.1±96.2)变形链球菌菌落数均显著减少(P<0.05);与0.9%氯化钠溶液组(914.9±132.1)相比,高氧液处理组(451.2±125.3)和0.5%次氯酸钠溶液组(301.4±92.2)黏性放线菌菌落数均显著减少(P<0.05);与0.9%氯化钠溶液组(710.8±131.2)相比,高氧液处理组(422.8±105.0)和0.5%次氯酸钠溶液组(126.5±90.6)中间普氏菌菌落数均显著减少(P<0.05)。使用高氧液、0.5%次氯酸钠溶液和0.9%氯化钠溶液分别处理三种细菌后,游标卡尺测量抑菌菌环直径,实验结果显示:与0.9%氯化钠溶液组(0.00 mm)相比,高氧液处理组(5.02±0.12mm)和0.5%次氯酸钠溶液组(6.52±0.24 mm)变形链球菌抑菌环直径均显著增大(P<0.05);与0.9%氯化钠溶液组(0.00 mm)相比,高氧液处理组(3.14±0.26 mm)和0.5%次氯酸钠溶液组(4.12±0.34 mm)黏性放线菌抑菌环直径均显著增大(P<0.05);与0.9%氯化钠溶液组(0.00 mm)相比,高氧液处理组(7.02±0.24 mm)和0.5%次氯酸钠溶液组(7.92±0.36 mm)中间普氏菌抑菌环直径均显著增大(P<0.05)。结论:高氧液对于根管内常见的三种致病菌有抑菌作用,高氧液对中间普氏菌的抑制作用高于变形链球菌和黏性放线菌。第二部分实验:高氧液对根管内三种常见致病菌作用的机制研究。目的:应用高氧液后,检测三种细菌SOD、Caspase-3基因表达情况,明确高氧液抑菌作用的机制。方法:复苏变形链球菌、黏性放线菌、中间普氏菌三种细菌于相应的平板中进行菌落形成实验,变形链球菌孵育24 h,黏性放线菌和中间普氏菌孵育48 h,光学显微镜下计数菌落数。取高氧液、0.9%氯化钠溶液处理的变形链球菌、黏性放线菌和中间普氏菌各一平板,提取细菌总RNA,将细菌总RNA反转录成cDNA进行实时定量PCR反应。采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。结果:与0.9%氯化钠溶液组(1097.5±144.2)相比,高氧液处理组(752.8±127.2)变形链球菌菌落数显著增多(P<0.05);与0.9%氯化钠溶液组(826.3±107.6)相比,高氧液处理组(425.4±108.9)黏性放线菌菌落数显著减少(P<0.05);与0.9%氯化钠溶液组(692.4±117.1)相比,高氧液处理组(415.4±113.2)中间普氏菌菌落数均显著减少(P<0.05)。实时定量PCR结果显示:与金黄色葡萄球菌(需氧菌)相较,变形链球菌、中间普氏菌、黏性放线菌的SOD基因表达均较低(P<0.05);与0.9%氯化钠溶液组相比,高氧液处理组变形链球菌、黏性放线菌和中间普氏菌的Caspase3基因表达显著上调(P<0.05)。结论:高氧液处理组及0.9%氯化钠组三种细菌Caspase 3基因表达结果显示高氧液处理组三种细菌程序性死亡均较0.9%氯化钠组增多。而这也与活菌形成实验结果相符。高氧液的抑菌作用可能是通过氧抑制作用,使细菌程序性死亡增加实现的。第三部分实验:高氧液对感染根管内常见致病菌抑制作用的实验研究。目的:进一步探究高氧液应用于临床根管冲洗后,能否抑制感染根管内的致病菌。方法:84例为慢性根尖周炎患者,无牙周病且为单根管的患牙共100个。患者近期(1月)没有接受任何抗生素的治疗,没有全身性疾病病史。慢性根尖周炎患者年龄段设置为:18-70岁,男39例,女45例。将患牙根据患者就诊顺序随机分为三组:高氧液组;0.9%氯化钠组;次氯酸钠液组。根管治疗时,采用各组冲洗液5 mL冲洗根管,将#30消毒纸捻插入根尖1/3处,维持1 min取出,经恒温培养的厌氧菌用划线法转种于血琼脂培养皿,培养48 h,观察菌落形成情况。采用SPSS 19.0软件进行方差分析和Tukey HSD检验比较不同冲洗剂对根管内常见感染细菌的抑菌效果。实验重复3次。采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析。结果:菌落形成实验结果显示:高氧液组细菌菌落数量高于次氯酸钠组(P<0.05),但明显低于0.9%氯化钠组(P<0.05)。结论:高氧液应用于根管冲洗,可能通过氧抑制作用,使根管内细菌程序性死亡增多,从而抑制感染根管内细菌生长。虽然高氧液抑菌效果低于次氯酸钠液,但是由于其具有安全性更高的优势,因而,在临床中仍然具有潜在的实用价值。
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