背景和目的牙髓组织位于牙齿的中心,是一种疏松的结缔组织,其血液供应主要来源于根尖孔细小的血管,没有有效的侧枝循环,在外界炎症等刺激作用下,牙髓组织的局部损伤通常都是不可逆的,可以导致牙髓组织的坏死并向根尖周组织进一步发展。牙髓组织具有形成牙本质的能力,在外界因素的影响下,也可以形成一种反应性/修复性牙本质。牙髓组织的这种功能,在牙齿的发育形成和修复再生当中起着非常重要的作用。人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)是人牙髓组织的主要细胞,也是牙本质的形成和再生过程中发挥重要作用的主要细胞。牙髓细胞在不同因子的影响下,具有分化成为各种类型细胞的潜力,如成骨细胞、成牙本质细胞等等。在牙髓组织的局部损伤修复过程中,主要依靠的是成牙本质细胞形成修复性牙本质从而发挥保护作用。根据以往文献报道,许多基因在这个过程中发挥一定的作用。牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,Dspp)就是牙本质当中的一种非胶原蛋白,能够调控牙齿的生长发育,在成牙本质细胞分化和牙本质矿化过程中发挥着重要的作用。Btbd7基因定位于人类染色体14q32.12区域,其编码的蛋白质由1132个氨基酸组成,相对分子质量为126368。Btbd7在各种癌症的侵袭和转移过程中起着非常重要的作用,包括肺癌、肝癌和唾液腺样囊性癌等。Btbd7作为一种调节基因,能够促进上皮组织的改建和支器官的形成。有研究表明,Btbd7是上皮组织重塑和分支器官形成的动态调节因子。在胚胎时期,肺、唾液腺和牙根的形成过程中发挥重要作用。课题组发现,Btbd7在大鼠牙髓中也有表达,然而,Btbd7在人牙髓细胞中的表达尚未被证实。课题组以往研究发现Btbd7基因存在于大鼠牙髓中,本课题同样检测出Btbd7存在于人牙髓细胞当中,我们利用小干扰RNA沉默人牙髓细胞中的Btbd7基因,从检测其对牙髓细胞增殖的影响和对Dspp基因影响的角度出发,进一步研究Btbd7对人牙髓细胞生物学行为的影响,从而推断Btbd7缺失是否会导致牙齿发育异常和钙化异常,在牙本质的形成和修复性牙本质的再生过程中发挥一定的作用。材料与方法1.选取出生后第5、8、11、15、19天的Wistar大鼠幼鼠,脱颈处死后解剖出上下颌骨,取其第一磨牙,脱矿后制作石蜡切片。进行HE染色、Btbd7免疫组化染色。观察不同时期大鼠牙胚组织的发育情况,根据免疫组化结果检测大鼠磨牙牙髓中Btbd7的表达。2.原代hDPCs的获取和细胞传代培养应用酶解组织块法从18-25岁的健康人第三磨牙中分离获得原代hDPCs。进一步传代培养,获取得生长状态良好的第3-5代细胞进行后续试验。3.细胞免疫组化对牙髓细胞进行Btbd7的免疫组织化学染色,对照组用PBS代替一抗。4.siRNA 转染应用 siRNA-Btbd7 或 siRNA-Ncontrol,以脂质体 Lipofectamine 2000为介导对hDPCs进行瞬时基因敲除。转染前,HDPCs在无双抗的细胞培养液中培养24h。转染后的细胞进一步培养48小时,采用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测基因敲除后Btbd7的表达水平。5.采用RT-PCR技术检测siRNA-Btbd7干扰48小时后hDPCs中Dspp基因的表达水平。6.采用Western blot技术检测siRNA-Btbd7干扰48小时后hDPCs中Dspp蛋白的表达水平。7.细胞增殖实验应用细胞增殖活性检测试剂盒(CCK-8)检测Btbd7对hDPCs增殖活性的影响。8.统计分析所有数据均采用SPSS17.0软件进行处理,设P<0.05,有统计学意义。结果1.HE染色结果:幼鼠出生后5天,牙胚处于钟状期晚期,磨牙冠部牙本质部分形成,牙颈部形成颈环结构,但上皮根鞘结构不明显,牙根尚未开始发育;第8天,磨牙冠部基本发育完成,根部开始发育,内、外釉上皮在颈环处增生,可以见到上皮根鞘结构;第11天,磨牙冠部发育进一步完善,根部上皮根鞘继续生长,牙本质继续发育,开始形成上皮隔;第15天,磨牙冠部发育完成,根部发育完成一半,可以见到根分叉结构;第19天,磨牙牙根基本形成,并继续生长。免疫组化染色:在Wistar大鼠的牙髓组织和体外培养的人牙髓细胞当中,可以观察到Btbd7阳性表达,染色主要位于成牙本质细胞和成纤维细胞的细胞质和细胞核上。2.转染结果:转染48小时后,在hDPCs中siRNA-Btbd7组与siRNA-Ncontrol组相比,Btbd7mRNA和DsppmRNA的表达水平均明显降低(P<0.05),Btbd7和Dspp蛋白的表达水平也明显降低(P<0.05)。3.CCK-8增殖活性实验结果显示siRNA-Btbd7与siRNA-Ncontrol对照组相比,hDPCs显著增殖。这表明Btbd7对hDPCs增殖有抑制作用。结论实验表明,在大鼠牙髓组织中存在Btbd7基因。在体外培养的人牙髓细胞当中同样也存在着Btbd7基因。siRNA沉默Btbd7基因后hDPCs增殖活性显著增强。由此可见,Btbd7在hDPCs中具有调控其细胞增殖的作用。在沉默Btbd7基因后,hDPCs中Dspp的表达也显著降低。这表明Btbd7可能通过调节Dspp的表达而参与牙本质的形成和再生,对牙齿的生长发育和矿化发挥影响作用。本研究为牙本质发育不全综合征等涉及到牙本质形成和矿化相关遗传性疾病的治疗提供了一定的理论依据。