研究背景胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,占所有恶性脑肿瘤的80%。而胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是胶质瘤中恶性程度最高的,约占所有胶质瘤的一半左右,具有高复发、预后差及致死率高的特点。目前胶质瘤的治疗以手术切除为主、辅助以放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗和肿瘤电场治疗。虽然现代积极的综合治疗方法在不断改进,但胶质瘤的治疗效果仍然很差。如何提高胶质母细胞瘤的治疗效果仍是神经外科迫切需要解决的问题。GBM的有氧糖酵解是其重要特征之一,GBM在其快速的增殖过程中需要大量能量及营养,有氧糖酵解在提供能量的同时还能产生大量代谢中间产物,为细胞增殖所需的物质合成提供原料。研究表明GBM中的有氧糖酵解关键酶基因表达升高,抑制GBM有氧糖酵解可以抑制GBM的增殖、侵袭及迁移,但调控GBM有氧糖酵解的分子机制仍不明确。酰基甘油激酶（Acylglycerol kinase,AGK）作为一种脂质代谢激酶,其在GBM中表达升高,并且与GBM的增殖,侵袭和迁移相关,但具体机制仍不明确。前期研究表明AGK能够调节PI3K/AKT/NFκB信号,影响GBM的增殖、凋亡、侵袭及迁移。同时,AGK位于线粒体内膜,对维持线粒体膜结构的稳定性有重要作用。线粒体膜的去极化是线粒体自噬的诱因之一,而线粒体是有氧糖酵解的发生场所,线粒体自噬会影响有氧糖酵解水平。前期研究通过改变AGK的表达,发现GBM的线粒体自噬水平及有氧糖酵解水平均有改变,同时,通过生物信息学分析也发现AGK与GBM免疫相关,然而AGK如何调节线粒体自噬,影响GBM有氧糖酵解和免疫的分子机制仍不清楚。由此本文提出AGK通过调节PI3K/AKT/NFκB信号,影响GBM的增殖、凋亡、侵袭及迁移,同时通过调节线粒体自噬,影响GBM有氧糖酵解和免疫的假说。为了验证以上假说,本文将分四部分进行研究论述:（1）AGK在人脑胶质瘤中的表达情况及其对患者预后的影响;（2）AGK对GBM增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响及其机制;（3）AGK对GBM线粒体自噬及有氧糖酵解的影响及其机制;（4）AGK对GBM肿瘤微环境的影响。第一部分酰基甘油激酶在人脑胶质瘤中的表达及临床预后分析目的:分析并检测AGK在人脑胶质瘤中的表达情况,分析AGK的表达与人脑胶质瘤临床预后的关系。方法:利用TCGA、CGGA及GTEx数据库下载胶质瘤及正常脑组织的基因表达数据及临床特征信息,利用R语言对数据进行整理,所有基因表达数据转换为TPM,使用单因素方差分析分析AGK的表达与肿瘤级别及各临床特征的关系。同时收集武汉大学人民医院神经外科手术切除的胶质瘤标本及正常脑组织,依据病理科诊断进行分类,采用实时荧光定量PCR技术检测AGK在各标本中的表达水平,免疫组化法回顾性分析71例脑胶质瘤患者AGK表达水平,依据免疫评分中位数将低于中位数的40例患者分为低表达组,高于中位数的31例患者分为高表达组。使用Wilcox检验和Kaplan-Meier检验分析AGK高表达与AGK低表达对患者生存时间的影响有无统计学差异。免疫荧光染色分析AGK在胶质母细胞瘤中的定位。P0.05）。另外pcDNA+DMSO组与AGK+PGAM5组相比,各时间点的细胞活力差异无统计学意义（P>0.05）,同样,shCtl+DMSO组与shAGK+PGAM5组相比明,各时间点的细胞活力差异无统计学意义（P>0.05）。免疫印迹结果显示,AGK组与pcDNA组相比,AGK蛋白表达水平升高,而PGAM5、BNIP3、NIX及LC3蛋白表达水平降低。而shAGK组与shCtl组相比,AGK蛋白表达水平降低,而PGAM5、BNIP3、NIX及LC3蛋白表达水平升高。pcDNA组与AGK+PGAM5组相比PGAM5、BNIP3、NIX及LC3蛋白表达水平差异无统计学意义。shCtl组与shAGK+shPGAM5组相比PGAM5、BNIP3、NIX及LC3蛋白表达水平差异无统计学意义。结论:AGK能够调节GBM有氧糖酵解及线粒体自噬,其分子机制是AGK通过抑制PGAM5从而抑制BNIP3/NIX引起的线粒体自噬,进而增加GBM的有氧糖酵解能力。第四部分AGK对GBM免疫微环境的影响目的:研究AGK对GBM免疫微环境的影响及其机制。方法:从Xena、CGGA数据库中下载胶质瘤及正常脑组织基因表达数据,包括200例正常脑组织、523例低级别胶质瘤组织及166例胶质母细胞瘤组织。将所有胶质瘤按照AGK表达高低分为AGK高表达组和AGK低表达组。利用Estimate包对两组进行免疫评分和基质评分。并对两组进行差异分析,对差异基因进行GO和KEGG分析。TIMER2.0网站在线分析AGK与各亚型免疫细胞的关系。从GEO数据库下载胶质瘤TAMs的数据,包括4个数据集中的20个胶质瘤样本和15个对照样本。分析AGK在TAMs中的表达及其与免疫检查点相关的基因CTLA4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、TIGIT和LPA受体家族基因LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6的关系。同时对3个GEO数据集GSE80338、GSE115397、GSE135437进行差异表达基因分析并取交集,KEGG及GO对差异基因进行分析,利用单细胞数据集GSE84465分析AGK和LPA受体家族基因在胶质母细胞瘤样本中各细胞类型中的表达情况。结果:利用Xena、CGGA数据库数据进行差异分析结果显示AGK高表达组与AGK低表达组之间共有510个差异基因,其中上调差异基因320个,下调差异基因190个。GO和KEGG分析结果显示AGK的表达高低与T细胞激活、免疫反应中的粒细胞活化、粒细胞去颗粒化及淋巴细胞分化等免疫反应及过程相关。AGK高表达组的基质评分和免疫评分均高于AGK低表达组。TIMER2.0网站在线分析结果显示,AGK表达水平与GBM的CD4+T细胞、单核细胞、髓样树突状细胞、NK细胞的浸润水平呈正相关,与巨噬细胞的浸润水平呈负相关。GSE80338数据集分析结果显示,AGK在TAMs中表达较正常对照组降低,免疫检查点相关基因中,PD1在TAMs中表达明显增多,而PDL1在TAMs中表达明显减少,而CTLA4、LAG3、TIM3及TIGIT在TAMs中的表达与正常对照组的表达差异无统计学意义。LPA受体家族基因中,LPAR1、LPAR2、LPAR5及LPAR6在TAMs中的表达均较正常对照组降低,而LPAR3及LPAR4在TAMs中的表达与正常对照组的表达差异无统计学意义。三个TAMs相关数据集GSE80338、GSE115397、GSE135437的差异分析取交集后共得到64个差异基因,其中有43个上调基因,21个下调基因。下调基因中包括了LPAR5及LPAR6。GO和KEGG分析结果显示差异基因与HIF-1信号通路、细胞粘附分子、信号转导、细胞粘附和血管生成等通路相关。单细胞数据集GSE84465分析结果显示AGK在GBM的星形细胞、肿瘤细胞、少突胶质细胞、血管内皮细胞、免疫细胞、神经元及少突胶质前体细胞中均有表达,而主要表达集中在肿瘤细胞中。LPAR1在GBM的在神经元中表达极低。LPAR2主要表达在免疫细胞中。LPAR3仅在星形细胞和免疫细胞中有少量表达。LPAR4在神经元及少突胶质细胞中几乎不表达,而在其他类型细胞中的表达也较少。LPAR5主要表达在免疫细胞中,极少量表达于肿瘤细胞,在其他类型细胞中几乎不表达。LPAR6在神经元中表达极低,而在主要表达在免疫细胞和肿瘤细胞中。结论:AGK与GBM的免疫相关,其催化产物LPA的受体中LPAR5及LPAR6可能与AGK一同在GBM免疫微环境中发挥作用。论文总结1.AGK在GBM中高表达,且与肿瘤级别相关,其表达量的增多还与生存时间减少及不良预后因子相关。2.AGK可以促进GBM的增殖、侵袭及迁移,抑制GBM的凋亡。3.AGK能够调节PI3K/AKT/NFκB信号通路。4.AGK可以促进GBM有氧糖酵解。5.AGK能够负性调控GBM线粒体自噬。6.AGK通过调节线粒体自噬影响GBM有氧糖酵解。7.AGK主要分布在GBM的肿瘤细胞和免疫细胞中,与多种免疫细胞浸润相关。