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目的:1.通过对Masquelet技术治疗临界骨缺损病例的回顾性分析,评价该方法在临界骨缺损临床应用中的治疗效果,为进一步优化治疗方案提供基础。2.构建一种稳定的Masquelet技术修复临界骨缺损实验动物模型,为后续进行药物干预及评价其对Masquelet技术修复临界骨缺损的影响奠定基础。3.基于Notch信号通路中相关因子的表达,观察骨碎补总黄酮干预对Masquelet技术修复大鼠股骨临界骨缺损的影响。方法:1.Masquelet技术治疗临界骨缺损临床病例的回顾性研究回顾性分析广州中医药大学第一附属医院自2014年1月至2020年12月期间采用Masquelet技术治疗临界骨缺损病例资料。本组共20例,收集分析患者的基础资料,观察指标包括:骨缺损长度、手术时间、固定方式、植骨方式、二期手术时机、手术次数、手术并发症、骨缺损愈合时间、负重时间、患侧肢体功能评价等。2.Masquelet技术修复临界骨缺损大鼠实验模型的构建与评价选取SPF级雄性SD大鼠20只,在右侧股骨进行手术截骨,造成4mm骨缺损区,采用钢板内固定,在骨缺损区植入PMMA（Polymethyl methacrylate）骨水泥旷置。4周后随机选取10只大鼠进行取材,观察大体外观,影像学及诱导膜组织形态学特点。剩余10只大鼠进行二期手术。二期手术取出PMMA骨水泥块后采用自体尾骨进行骨缺损区植骨,并仔细缝合诱导膜。术后12周取术侧股骨标本,通过大体观察、影像学检测及组织形态学方法评价骨缺损区的修复与重建情况。3.基于Notch信号通路探讨骨碎补总黄酮对Masquelet技术修复临界骨缺损影响的实验研究选取SPF级雄性SD大鼠96只,按体重分层后随机分为4个组:中药组、空白组、中药+阻遏剂组、阻遏剂组,每组24只。采用第二部分中的造模方法成功造模后,于术后第二天开始中药组及中药+阻遏剂组动物给予骨碎补总黄酮灌胃,空白组及阻遏剂组给予等量纯水灌胃。阻遏剂采用Notch信号通路阻遏剂γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯{N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl-Lalanyl）]-Sphenylgly-cinetbutyl ester),DAPT}为阻遏剂组及中药+阻遏剂组动物进行皮下注射,中药组及空白组动物则采用二甲亚砜进行皮下注射。术后第28天,各组随机选取12只大鼠获取诱导膜组织进行相关指标检测。通过X线检测观察钢板、螺钉、PMMA骨水泥块及截骨端对位对线情况。采用HE染色观察各组诱导膜组织组织形态学特点。通过免疫组化及western-blot检测各组诱导膜组织中Notch信号通路相关蛋白BMP-2、VEGFA、Notch1、Hes-1的表达;通过q-PCR分析各组诱导膜组织中上述因子的m RNA表达情况。剩余48只大鼠进行二期手术。二期手术取出PMMA骨块后采用自体尾骨进行股骨缺损区植骨。二期术后12周取材,通过大体观察、影像学以及组织形态学方法观察骨缺损区的愈合与修复情况。通过免疫组化及western-blot检测上述Notch信号相关因子的表达。结果:1.Masquelet技术治疗临界骨缺损临床病例的回顾性研究20例患者中,开放性骨折导致的骨缺损6例,骨髓炎患者14例。在14例骨髓炎患者中,6例为金黄葡萄球菌感染,3例为铜绿假单胞菌感染,1例为路邓葡萄球菌感染,1例为产气肠杆菌感染,其余3例培养为阴性。经采用Masquelet技术治疗后,临床症状均较术前改善。本组病例平均骨缺损长度5.8±2.2cm,骨水泥旷置时间为5.4±1.4周。16例患者在治疗后1年内获得骨性愈合,骨性愈合的时间平均为6.8±2.2个月。一期采用外支架固定患者其手术再感染率较其他固定方式低,二期手术采用髓内钉固定的患者负重时间早于其它固定方式。所有患者均采用自体髂骨植骨,4例骨缺损超过8cm患者采用自体骨联合同种异体骨方式,2例患者采用自体髂骨联合富血小板血浆（PRP）方式进行植骨。术后随访中1例患者在二期手术后8个月复诊发现钢板断裂,另有1例出现外固定松动,此2例患者均在翻修手术中更改为髓内钉固定。4例患者出现再感染,通过再次清创、重新一期骨水泥旷置处理后均可控制感染。Pely骨与功能评级,患肢功能4例为优,9例为良,6例可,1例差。2.Masquelet技术修复临界骨缺损大鼠实验模型的构建与评价本次实验共选取20只大鼠进行造模手术。实验大鼠术后均能正常进食、排便,术后第3天内恢复正常行走。1只大鼠出现手术切口感染;另1只大鼠术侧肢体持续性肿胀、膝关节活动受限,X线检测证实螺钉松动,骨水泥移位。此2只大鼠退出后重新补齐。经X光检测,其余动物模型截骨断端对位、对线良好,钢板及螺钉均在位无松脱;PMMA骨水泥在位,骨缺损区维持4mm间隙。一期手术后4周,骨水泥周围可形成诱导膜。诱导膜组织内层含丰富的新生微血管,外层主要为成纤维细胞和胶原组织。诱导膜组织中可见大量炎症细胞浸润,炎症细胞主要聚集在诱导膜近骨水泥缘。二期手术后12周,X线检测可观察到骨缺损区内有新骨形成。3.基于Notch信号通路探讨骨碎补总黄酮对Masquelet技术修复临界骨缺损影响的实验研究造模后28天,各组X线检测显示钢板、螺钉及PMMA的位置良好,固定牢靠,截骨端对位对线良好。总体而言,诱导膜的western blot检测结果表明与其他各组比较,中药组中Notch信号通路相关因子BMP-2、VEGFA、Notch1、Hes-1的蛋白表达明显提高（P<0.05）。q-PCR检测结果显示与其他各组比较,中药组中上述因子的基因表达提高（P<0.05）。阻遏剂组Notch信号通路相关因子的基因表达均下调（P<0.05）。免疫组化结果显示中药组诱导膜组织中BMP-2、VEGF、Notch1、Hes-1均有较强表达。二期手术后12周,X线检测及组织形态学结果显示中药组骨缺损区有较好的修复,Micro-CT显示中药组及空白组骨缺损区骨质矿化效果较好。免疫组织化学显示骨碎补总黄酮能促进BMP-2、VEGFA、Notch1、Hes-1等蛋白的表达。中药组在新生微血管形成、新骨形成、骨质矿化及组织形态学方面均优于其它组。结论:1.Masquelet技术是治疗临界骨缺损的一项可靠的手术技术。合理把握手术指征,周密的手术计划,细致的术中操作可以提高临界骨缺损的愈合率,实现临界骨缺损的修复重建。2.本研究中Masquelet技术治疗股骨临界骨缺损SD大鼠实验模型的构建方法成功率较高、稳定可行,具备可重复性。3.骨碎补总黄酮可能通过上调Notch信号通路促进Masquelet技术中诱导膜及新生骨组织中微血管形成,从而对临界骨缺损修复具有一定的促进作用。