山莨菪Anisodus tanguticus(Maxim.)Pascher为茄科山莨菪属植物,是提取莨菪烷类生物碱的重要资源植物,又是藏族民间习用的镇痛和镇静草药,藏医以根或种子入药。四川的山莨菪根野生资源极为丰富,主要分布在甘孜州和阿坝州,目前除当地藏医作为药材使用外,大量资源没有充分利用。民族药具有鲜明的地域性和民族特色,虽然我国在民族药研究上取得了一定的成就,但整体水平仍然偏低,进而严重制约了其产业化发展。对民族药的品种和质量进行系统的整理和研究,制定科学合理的民族药质量标准,可为民族药及其产品提供核心竞争力,是发展民族药产业的重要技术保证。本文基于藏药山莨菪根的研究和应用现状,立足藏医药基本理论,针对山莨菪根的藏医药效用,引入现代药理学及化学成分分离分析技术,进行其药效物质基础及系统的品质评价研究,进而拟订其质量标准(草案),解决其“非标”现状,对药监部门加强藏药材的质量管理、保证藏医临床用药的安全有效及进一步的资源开发利用具有重要意义。研究的方法、结果和结论如下:1山莨菪根的药效物质基础研究1.1化学成分研究通过提取、浓缩、萃取、层析色谱、大孔吸附树脂富集、制备色谱分离和富集等分离和纯化技术,结合对照品指认、核磁共振波谱仪和质谱仪等鉴定方法,从藏药山莨菪根中分离得到7个化合物,其中有4个莨菪烷类生物碱(东莨菪碱、樟柳碱、阿托品和山莨菪碱),1个酰胺类化合物(咖啡酰丁二胺),2个香豆素苷类化合物(法荜枝苷和东莨菪苷)。咖啡酰丁二胺、法荜枝苷和东莨菪苷为山莨菪根中的水溶性化学成分,系首次从该药材中分离得到。该研究进一步阐述了山莨菪根的化学物质基础,为阐明其药效物质基础及品质评价提供了科学依据。1.2急性毒性、镇痛和镇静作用研究通过最大耐受量试验对藏药山莨菪根的急性毒性进行了研究,结果表明,山莨菪根在1日内对小鼠最大给药量为24.00 g/kg,相当于人用量的480倍,故认为相关著作的推荐使用剂量是安全的。通过小鼠醋酸扭体试验、热板试验和水合氯醛催眠试验对山莨菪根的镇痛和镇静作用进行了研究,结果表明,山莨菪根(0.25、0.50、1.00或2.00 g/kg)能显著延长小鼠扭体反应潜伏期及睡眠时间、降低小鼠扭体反应次数、提高小鼠痛阈值和缩短小鼠睡眠潜伏期,显示有明显的镇痛和镇静作用。1.3“谱效关系”研究1.3.1药效学研究通过小鼠醋酸扭体试验和水合氯醛催眠试验,对18批山莨菪根样品的镇痛和镇静作用进行研究,结果表明,各批山莨菪根样品(2.00 g/kg)均显著降低小鼠扭体反应次数和延长小鼠睡眠时间,显示有明显的镇痛和镇静作用。1.3.2 HPLC-DAD分析建立了上述药效学样品的HPLC-DAD指纹图谱分析方法,对上述药效学样品进行分析,得到含16个共有峰的指纹图谱,其中共有峰1、2、6、7、8、9和12分别被指认为咖啡酰丁二胺、樟柳碱、法荜枝苷、东莨菪苷、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品。建立了上述药效学样品中咖啡酰丁二胺、樟柳碱、法荜枝苷、东莨菪苷、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品含量的HPLC-DAD测定方法,对上述药效学样品进行含量测定,结果表明,小鼠每日灌胃液中咖啡酰丁二胺、樟柳碱、法荜枝苷、东莨菪苷、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品的含量分别为0.31~5.17 mg/kg、0.66~8.60 mg/kg、3.26~15.19 mg/kg、0.46~7.21 mg/kg、0.09~6.44 mg/kg、0.15~3.86mg/kg和0.51~19.44 mg/kg。1.3.3相关性分析通过SPSS 21.0对共有峰峰面积或上述7个化学成分的含量与扭体抑制率或睡眠时间延长率进行双变量Pearson相关性分析。结果表明,除共有峰3、14和16的峰面积与扭体抑制率呈负相关,共有峰3、5、14和16的峰面积与睡眠时间延长率呈负相关,其它相关性均为正相关。即已知的7个化学成分(咖啡酰丁二胺、樟柳碱、法荜枝苷、东莨菪苷、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品)在山莨菪根的镇痛和镇静作用中均具有贡献度,表明这7个化学成分可能为藏药山莨菪根的药效物质基础。该研究为后续藏药山莨菪根品质评价指标成分的选择提供了科学依据。相关内容已发表于Tropical Journal of Pharmaceutical Research杂志上。2山莨菪根的品质评价研究2.1资源分布及产地调研通过对山莨菪根的相关文献研究及四川主产区的实地调研,初步弄清了四川省藏药山莨菪根的资源分布、品种和使用情况。四川省使用的藏药山莨菪根主流品种是茄科植物山莨菪A.tanguticus,该植物资源丰富,药材均来源于野生,当地藏医一般是就近取材使用,目前主要作为藏医民间使用的镇痛和镇静草药。由于缺乏相关的基础研究,其资源没有得到充分利用。2.2形态组织学研究采用生药学常规方法,进行了藏药山莨菪根的形态组织学研究,确定了原植物、药材性状、显微构造上的主要鉴别特征。原植物形态上,主要从叶缘是否具啮蚀状细齿、花冠颜色、花萼是否被毛、果是否直立等方面进行鉴别;药材性状上,主要从形状、表面特征、断面的同心层纹、气味等方面进行鉴别;显微方面,主要从根横切面木质部的异常构造(木间韧皮部)及粉末中的淀粉粒、草酸钙砂晶和导管等特征进行鉴别。2.3理化鉴别研究2.3.1薄层色谱建立了山莨菪根中生物碱类成分(樟柳碱、东莨菪碱和阿托品)和香豆素苷类成分(法荜枝苷和东莨菪苷)的薄层色谱鉴别方法。通过对18批山莨菪根样品的鉴别,表明建立的方法有较好的适应性,重现性好。根据研究结果,并综合考虑可操作性,建议选择阿托品为对照品对山莨菪根的生物碱类成分进行薄层色谱鉴别;选择法荜枝苷和东莨菪苷为对照品对山莨菪根的香豆素苷类成分进行薄层色谱鉴别。2.3.2 HPLC-DAD指纹图谱建立了山莨菪根HPLC-DAD指纹图谱分析方法。该方法稳定、可靠、重现性好,可利用山莨菪根样品HPLC色谱图与对照HPLC色谱图的相似度对其进行品质分析。根据研究结果,山莨菪根HPLC图谱中应呈现16个色谱峰,选择6号色谱峰(法筚枝苷)为参照色谱峰,16个色谱峰的相对保留时间为:0.49(峰1)、0.58(峰2)、0.62(峰3)、0.72(峰4)、0.86(峰5)、1.00(峰6)、1.07(峰7)、1.14(峰8)、1.23(峰9)、1.38(峰10)、1.56(峰11)、1.74(峰12)、2.14(峰13)、2.34(峰14)、2.49(峰15)、2.72(峰16),各色谱峰相对保留时间应在规定值的±5%以内。2.4常规检查、重金属及有害元素检测和农药残留筛查研究2.4.1水分及灰分测定按照2015年版《中国药典》第四部通则相关方法,测定了18批山莨菪根样品的水分及灰分(总灰分和酸不溶性灰分)。18批山莨菪根样品水分含量为5.2~14.1%,平均为7.7%;总灰分含量为3.7~12.6%,平均为8.3%;酸不溶性灰分含量为0.2~2.8%,平均为1.2%。根据实测数据,结合生产实际,建议其限量标准为水分不得过10.0%,总灰分不得过12.0%,酸不溶性灰分不得过3.0%。2.4.2重金属及有害元素检测建立了山莨菪根中铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)和砷(As)的ICP-MS测定方法。对18批山莨菪根样品进行Pb、Cd、Hg、Cu和As的检测,结果表明,山莨菪根样品中Pb、Cd、Hg、Cu和As的含量分别为0.20~1.70 mg/kg、0.05~0.26 mg/kg、0.02~0.19 mg/kg、2.98~13.94 mg/kg和0.10~0.94 mg/kg。对照现行版《中国药典》的相关规定,所测样品全部符合规定。根据检测结果,结合生产实际,建议不对其Pb、Cd、Hg、Cu和As进行限量规定。2.4.3农药残留筛查采用GC-MS/MS法对18批山莨菪根样品的农药残留情况进行了筛查,结果表明,一些批次山莨菪根样品中含有β-六六六、加保扶(克百威)、异噁草酮、灭蚁灵或伏杀硫磷农药。四川省山莨菪根全为野生,其农药残留筛查结果提示随着人类活动的影响,野生药材也有可能受到农药污染,应该引起相关学者和政府部门的注意。但考虑生产实际,建议本品暂不对相关农药进行限量规定。基于此,本文还研究提出了一种农药MRM离子对的优选方法,此方法可提升农药检测的准确度,并可用于所有通过MRM模式定量的化合物的离子对优选,相关内容已发表于Food Control和Journal of Chromatography B杂志上。2.5浸出物及有效成分含量测定2.5.1浸出物含量测定筛选确定了山莨菪根浸出物测定的溶剂和方法,即95%乙醇为溶剂,热浸法测定。并进行了18批山莨菪根样品的醇溶性浸出物测定,结果表明,各样品浸出物含量为13.4~22.8%,平均为19.1%。根据测定结果,结合生产实际,建议本品95%乙醇浸出物含量不得少于10.0%。2.5.2总生物碱含量测定建立了山莨菪根中总生物碱含量的分光光度法测定方法。并进行了18批山莨菪根样品的测定,结果表明,其总生物碱含量为1.58~5.16%,平均为3.45%。根据测定结果,结合生产实际,建议本品总生物碱(以阿托品计)的限度标准为不得少于2.0%。2.5.3樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品含量测定建立了山莨菪根中樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品含量的HPLC-DAD测定方法。并进行了18批山莨菪根样品的测定,结果表明,其樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品的含量及这4种生物碱总量分别为0.050~0.538%、0.003~0.118%、0.004~0.422%、0.015~0.824%和0.145~1.172%。根据测定结果,考虑4种生物碱的相似性(均为莨菪烷类生物碱),结合生产实际,建议本品4种生物碱总量的限度标准为不得少于0.30%。2.5.4咖啡酰丁二胺、东莨菪苷和法荜枝苷含量测定建立了山莨菪根中咖啡酰丁二胺、东莨菪苷和法荜枝苷含量的HPLC-DAD测定方法。并进行了18批山莨菪根样品的测定,结果表明,其咖啡酰丁二胺、东莨菪苷和法荜枝苷的含量分别为0.025~0.585%、0.056~0.549%和0.362~1.710%;东莨菪苷和法荜枝苷的总量为0.446~2.229%。根据测定结果,考虑东莨菪苷和法荜枝苷的相似性(均为香豆素苷类化合物),结合生产实际,建议本品咖啡酰丁二胺的限度标准为不得少于0.050%,东莨菪苷和法荜枝苷总量的限度标准为不得少于0.70%。2.6质量标准(草案)基于对四川省藏药山莨菪根的药效物质基础及品质评价研究,并考虑生产实际和标准的可操作性,拟订了其质量标准(草案),该标准部分内容已收入2014年版《四川省藏药材标准》。本文通过研究解决了四川省藏药山莨菪根的“非标”现状,对药监部门加强藏药材的质量管理、保证藏医临床用药的安全有效及进一步的资源开发利用具有重要意义。