超长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids，VLCPUFAs)是指含3个或3个以上双键且碳链长度大于18个碳原子的直链脂肪酸，如花生四烯酸(AA，20∶4Δ5，8,11,14)、二十碳五烯酸(EPA，20∶5Δ5，8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6Δ4，7,10,13，16，19)，其中EPA和DHA是鱼油的有效成分，对人体的身体健康有着重要的作用，但人体自身合成能力有限，需要通过日常饮食补充足够的VLCPUFAs来维持身体健康。目前，VLCPUFAs的主要来源是海藻油和深海鱼类。但海藻的富集培养容易产生副产物和毒素，而且近些年海洋污染日益加剧以及人类对深海鱼类的过度捕捞，使得鱼油产量和质量急剧下降，已经无法满足人类日常生活的需求，需要寻找一条可持续的绿色途径来生产VLCPUEAs。近些年的研究结果表明，利用基因代谢工程在高等植物中合成EPA和DHA是可行的。目前，限制转基因植物商业化生产鱼油的主要因素是转基因植物中EPA和DHA产量较低，非特异性脂肪酸增多，因此克隆并鉴定高催化活性、强专一性的酶基因是提高转基因鱼油质量与产量的有效方法之一。　　 本研究在转基因拟南芥中鉴定了球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5的功能;在烟草中重组了马铃薯致病疫霉EPA的合成途径，从分子生物学水平证明了马铃薯致病疫霉是通过Δ6传统途径合成EPA;并且对EPA和DHA合成途径的关键酶基因进行密码子优化，提高了基因异源表达的水平;同时，在原有多基因辅助载体基础上，构建了一系列含有不同启动子的多基因聚合辅助载体，扩大了该载体的应用范围，并利用该载体构建了多个EPA合成表达载体，对高等植物进行遗传转化，在拟南芥和棉花中生成了AA和EPA。主要结果如下:　　 (1)球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定　　 从球等鞭金藻中克隆到一个Δ5去饱和酶基因，命名为IgD5，我们将IgD5转化能够内源合成二高-γ-亚麻酸(DGLA，20∶3Δ8，11,14)和二十碳四烯酸(ETA,20∶4Δ8，11，14,17)的已转二基因的拟南芥（TMA2），通过PCR及RT-PCR筛选阳性植株，提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸，用气相色谱分析法检测到AA和EPA，含量分别达7.44％和2.07％，转化效率分别为68％和60％，证明IgD5在转基因植物中具有Δ5去饱和酶的活性，对ω3/ω6脂肪酸没有明显偏好性，并且催化活性远高于其在酵母中的活性。在转IgD5的TMA2中除了AA和EPA，没有检测到其他新脂肪酸产生，表明IgD5底物专一性也很强。本研究表明IgD5是一个可用于植物转基因替代生产鱼油的良好基因。　　 (2)马铃薯致病疫霉EPA合成途径在植物中的重组鉴定　　 马铃薯致病疫霉含有丰富的EPA，通过同源克隆，在马铃薯致病疫霉中克隆到两个去饱和酶基因PinD6和PinD5。生物信息学分析表明，这两个去饱和酶具有“Front-end”去饱和酶的4个保守区。利用实验室已有的多基因辅助载体，将这两个基因连同PinE6串联到一个植物表达载体中，对烟草进行遗传转化，通过PCR筛选阳性植株，在转基因烟草叶片中检测到0.8％的EPA，在转基因烟草中没有检测到非特异性脂肪酸，说明PinD6和PinD5专一性很强。从而从分子生物学水平证明马铃薯致病疫霉通过Δ6途径合成EPA。由于马铃薯致病疫霉在侵染植物时，会将AA和EPA释放到植物中，引起植物的免疫反应，因此马铃薯致病疫霉EPA合成途径的确立对进一步研究其致病机理和防治措施有重要意义。　　 (3)马铃薯治病疫霉Δ5去饱和酶基因的密码子优化　　 Δ5去饱和酶催化的是Δ6传统途径和Δ8替代途径都必经的最后一部反应，对于AA和EPA的生成起着重要作用。本实验室已从马铃薯治病疫霉中成功克隆到Δ5去饱和酶，但其在酵母中活性很低。通过分析Δ5去饱和酶基因在酿酒酵母中表达时的密码子使用频率，发现其5端部分密码子使用率很低，因此我们将其5端16个密码子全部优化成酿酒酵母中高效利用的密码子，编码氨基酸不变。转化酿酒酵母进行活性检测，与未优化的Δ5去饱和酶基相比，5端优化后的Δ5去饱和酶活性提高1倍，说明密码子优化可以提高VLCPUFAs合成酶基因在酵母中的表达水平。　　 (4)多基因辅助载体的系列化改造　　 VLCPUFAs合成途径中相关酶基因在植物中的功能鉴定以及EPA在油料作物中的异源合成是一项庞大的基因代谢工程，需要通过遗传转化将多个外源去饱和酶基因和链延长酶基因导入植物，为了解决多基因转化的难题，我们在原有的多基因辅助载体pAUX2基础上，构建了一系列含有不同启动子的多基因辅助载体，包括pASA1(35S)、pASA2(Napin)、pASA3(Ubi)和pASA4(Actin)，其都含有AvrⅡ--SpeⅠ-AvrⅡ结构;pAUX3(Napin)载体，其含有XbaⅠ--AvrⅡ-XbaⅠ结构。　　 (5)多基因系列辅助载体在植物EPA异源合成中的应用　　 为了验证多基因辅助载体的可行性，我们利用该系列载体构建了含有35S启动子的EPA合成表达载体以及含有Napin启动子的EPA合成表达载体，分别转化拟南芥，通过气相色谱分析转基因拟南芥种子中脂肪酸成分，检测到EPA的生成，说明EPA合成相关基因已成功转化到拟南芥中，并且得到了表达，验证了辅助载体的可行性和易用性。同时，我们还利用多基因辅助载体将Δ9链延长酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶因和Δ15去饱和酶的4个酶基因串联到植物表达载体pCambia2300中。利用农杆菌介导法将四基因表达载体pCambia2300-4EC转入棉花，在农作物代谢工程实践应用中验证该辅助载体的可行性和稳定性。通过卡纳霉素和PCR筛选获得12株转基因阳性植株，提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸，用气相色谱分析法检测到AA和EPA，其中两株叶片中AA和EPA的平均含量分别达1.0％和5.0％。以上结果表明，利用多基因辅助载体和其系列化辅助载体能快速高效地实现多基因在植物中的有效聚合和稳定表达，为农作物多基因性状改良及植物代谢工程提供了技术工具，同时，EPA在棉花中的异源合成也为进一步在棉籽中生产VLCPUFAs奠定了基础。