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一、研究背景乳腺癌是威胁女性生命健康的主要恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率分别位居女性恶性肿瘤中的第一位和第二位。虽然近年来乳腺癌患者的早期筛查、手术、放化疗、内分泌治疗、靶向治疗的综合应用对乳腺癌患者的总生存期有所提高,但是乳腺癌患者的耐药与复发仍不可避免,成为乳腺癌治疗失败的主要原因之一。发现新的治疗靶点是乳腺癌治疗的难点。众所周知,乳腺癌干细胞假说认为乳腺癌干细胞是乳腺癌复发、耐药的根源,因此探讨乳腺癌干细胞的调控机制,发现调控乳腺癌干细胞的新靶点具有深远的意义。课题组前期研究通过基因芯片数据筛选出了对乳腺癌干细胞具有重要调控作用的mi R-20b-5p(hsa-mi R-20b-5p),生物信息学分析发现mi R-20b-5p可能与乳腺癌干细胞的增殖、凋亡等功能相关。二、研究目的基于前期基因芯片及生物信息学分析数据,筛选到对乳腺癌干细胞有重要调控作用的mi RNA为mi R-20b-5p,mi R-20b-5p可能与乳腺癌干细胞的增殖、凋亡等功能相关,本研究将继续验证mi R-20b-5p对乳腺癌干细胞增殖、凋亡功能是否确实有影响,并进一步探讨其机制。三、研究方法首先,通过无血清诱导培养T47D和MCF-7细胞株成球生长为乳腺癌干细胞样细胞,通过q RT-PCR分析乳腺癌干细胞样细胞及乳腺癌细胞中干性基因的表达差异、流式分析乳腺癌干细胞样细胞及乳腺癌细胞中CD44+CD24-/low干细胞群比例差异鉴定乳腺癌干细胞的诱导培养是否成功;进一步通过q RT-PCR检测乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中mi R-20b-5p的表达差异。通过在T47D-CSCs中构建mi R-20b-5p的过表达和抑制体系,Ed U细胞增殖实验、凋亡实验分析mi R-20b-5p对乳腺癌干细胞增殖和凋亡能力的影响。其次,通过RNAfold和Bibiserv2在线数据库比较E2F1 3’-UTR的RNA折叠自由能,mi R-20b-5p与E2F1 3’UTR结合的最小自由能的差异;双荧光素酶报告基因实验验证mi R-20b-5p是否与潜在靶基因E2F1的3’UTR直接作用;Western blotting分析mi R-20b-5p对乳腺癌干细胞中E2F1蛋白表达水平的影响。第三,体内实验验证mi R-20b-5p对乳腺癌细胞移植瘤生长能力的影响以及对E2F1表达水平的影响。四、研究结果1.基于前期生物信息学研究筛选出对乳腺癌干细胞有重要调控作用的mi RNAs,其中调控维度最高的mi RNAs之一为mi R-20b-5p。本研究通过无血清培养诱导MCF-7、T47D乳腺癌细胞成球生长,通过流式分析显示乳腺癌干细胞样细胞中CD44+CD24-/low干细胞群比例升高,干性基因表达分析OCT4、NANOG、SOX2在MCF-7-CSCs中分别升高3.00、10.76、13.35倍,T47D-CSCs中分别升高7.00、96.73、45.97倍,证明乳腺癌干细胞诱导培养成功。q RT-PCR分析结果表明mi R-20b-5p在乳腺癌干细胞中表达升高,MCF-7-CSCs、T47D-CSCs中分别升高倍3.91、2.19倍,(P=0.004;P=0.006)。2、在乳腺癌干细胞中用过表达和抑制mi R-20b-5p的慢病毒感染T47D-CSCs,构建乳腺癌干细胞中mi R-20b-5p的过表达及抑制体系,Ed U增殖实验结果显示过表达的空载体组、mi R-20b-5p过表达组细胞增殖比例:35.7%、40.9%,(P=0.011);抑制的空载体组、mi R-20b-5p抑制组的细胞增殖比例分别为:41.0%、36.9%,(P=0.012)。凋亡实验结果显示:过表达的空载体组、mi R-20b-5p过表达组细胞凋亡比例:8.15%、4.82%,(P=0.004);抑制的空载体组、mi R-20b-5p抑制组的细胞凋亡比例7.82%、13.34%(P=0.011)。3.基于课题组前期发现mi R-20b-5p增殖相关的潜在靶基因可能为E2F1,本研究Western blotting结果显示过表达mi R-20b-5p可下调E2F1蛋白水平的表达,相反,抑制mi R-20b-5p的表达可上调E2F1蛋白水平的表达;与T47D细胞相比,T47D-CSCs中E2F1表达下调。双荧光素酶报告基因实验结果显示mi R-20b-5p在分子水平可与E2F1的3’UTR直接结合,下调双荧光素酶活性18.60%,(P=0.003)。4.通过裸鼠成瘤动物实验模型验证了mi R-20b-5p在体内仍有明显的促癌作用,在成瘤组织中免疫组化分析显示过表达mi R-20b-5p组可明显抑制E2F1的表达。五、结论本研究成功诱导和鉴定了乳腺癌干细胞,在前期生物信息学研究初筛获得乳腺癌干细胞特征性mi R-20b-5p的基础上,发现mi R-20b-5p在乳腺癌干细胞中表达升高,在功能水平验证了mi R-20b-5p可促进乳腺癌干细胞的增殖、并抑制其凋亡,在蛋白水平和分子结构水平验证了E2F1为mi R-20b-5p的真实靶基因,在动物实验水平验证了mi R-20b-5p下调靶基因E2F1的表达,从而促进乳腺癌移植瘤的生长能力。