乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,据资料统计,发病率占女性全身各种肿瘤的10.4%,并且在全世界肿瘤的发生中排列第五。目前乳腺癌的治疗方法主要有：手术,放疗,化疗以及内分泌治疗。手术治疗仍为乳腺癌的主要治疗手段之一,但是基于乳腺癌在确诊时已是一种全身性疾病,全身化疗的目的就是根除机体内残余的肿瘤细胞以提高外科手术的治愈率,而在乳腺癌患者化疗过程中所面临的困难之一就是对化疗药物的耐药问题。越来越多的研究表明,对化疗药物耐药的乳腺癌患者,其体内某些生长因子受体的表达高于对化疗药物敏感的患者,例如：人表皮生长因子二型受体,胰岛素样生长因子Ⅰ型受体等。这些生长因子受体的上调往往会引起其下游分子的激活或过表达,例如,Akt,细胞外信号调节激酶(ERKs),p38以及p21活化的蛋白激酶1,提示了这些生长因子受体以及其下游分子的表达与修饰也许与乳腺癌患者对化疗药物耐药有关,但是具体机制尚有待进一步探讨。P21活化蛋白激酶(P21 activated protein kinases, Paks)家族是一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,它们最早是作为Rho GTP酶Cdc42和Racl的特异性结合物而被发现的,后来证明Paks家族在细胞的一些生理过程,例如,细胞迁徙,细胞生长,细胞分裂,细胞凋亡以及内分泌激素信号通路中起着重要的作用。到目前为止,在哺乳类动物细胞中,已经有6个Pak家族成员被确定,Pak1-3属于Ⅰ类Pak家族,Pak4-6则被归为Ⅱ类Pak家族。其中,Pak1被认为与细胞生长有关。研究表明,Pak1通过磷酸化Bad在丝氨酸112位点和丝氨酸136位点从而促进细胞的生长,Pak1也可以通过磷酸化雌激素受体的丝氨酸305位点,引起细胞周期调节蛋白D1的表达,进而使乳腺癌细胞对于雌激素的依赖性减弱。有趣的是,同属于I类Pak家族成员的Pak2,与Pak1有着总体76%的序列同源性以及催化亚基96%的序列同源性,却有着与Pak1不同的功能。实验表明,Pak2既可以促进细胞生长,也可以引起细胞凋亡。Pak2可以被磷酸肌醇3激酶和Akt活化,进而促进细胞的生长。然而,当外界刺激来临,例如,UV的辐射或者化疗药物的出现,Pak2就会被Caspase-3切割并活化,产生一个活性片段,Pak2p34,这个片段进而从细胞浆转移到细胞核中,引起细胞凋亡的发生。最近发现,Caspase-8和-10也有类似切割并活化Pak2的功能。我们之前的实验结果显示,Pak2可以磷酸化c-Jun n的五个苏氨酸位点(苏氨酸2,8,89,93和286),从而促进表皮生长因子(EGF)诱导的细胞生长和转化。Jerry W.Marlin等人报导,Pak2可以通过抑制Caspase-3的活性以及自身的被切割,从而使Pak2活性较低的乳腺癌细胞Hs578T相比较Pak2表达较高的MCF-7和MDA-MB-468细胞,对于化疗药物诱导的细胞凋亡更加敏感,这就提示我们Pak2在抑制化疗药物引起的肿瘤细胞凋亡的过程中起着一定的作用,然而,具体的作用机制却有待于进一步的讨论。本研究采用人乳腺导管癌组织芯片以及不同种类的人乳腺癌细胞,研究Pak2在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的表达；通过研究Pak2对Caspase-7的修饰作用,Pak2对Caspase-7功能的影响以及下调Pak2的表达对化疗药物诱导的乳腺癌细胞凋亡的影响,来探讨Pak2参与乳腺癌细胞对化疗药物耐药的机制,提供阻断Pak2促进肿瘤细胞凋亡的策略,为Pak2作为乳腺癌患者治疗的新靶标提供一定的实验和理论基础。第一章Pak2在人乳腺癌组织和乳腺癌细胞中高表达方法1.乳腺癌组织芯片检测Pak2在乳腺肿瘤组织中的表达情况,用癌旁正常组织作为对照。2. Western blotting检测不同乳腺癌细胞系中Pak2, Caspase-3, Caspase-7的表达情况,用正常乳腺上皮细胞MCF-10A作为对照。3.流式细胞仪检测十字孢碱诱导MCF-7乳腺癌细胞的凋亡情况。4. Western blotting检测十字孢碱诱导后,MCF-7细胞中Pak2, Pak2p34,磷酸化Pak2 (Ser141), Caspase-7, Cleaved-Caspase-7的表达情况。结果1.与乳腺癌癌旁正常组织相比,Pak2在乳腺癌组织中高表达用100例不同分期的乳腺癌组织和10例癌旁正常组织相比较,免疫荧光结果显示乳腺癌组织中Pak2的平均表达水平在43.67,而癌旁正常组织的Pak2的平均表达水平只有17.47,说明相比较癌旁正常组织,Pak2在乳腺癌组织中呈高表达状态(P<0.01)。2.与正常乳腺上皮细胞相比,Pak2在乳腺癌细胞系中高表达Western blotting结果显示,与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,Pak2在不同乳腺癌细胞系中均呈现高表达状态。其中,MCF-7细胞中Pak2表达水平最高。除了MCF-7细胞中没有Caspase-3表达外,其余细胞均有Caspase-3与Caspase-7的表达。3.十字孢碱可以诱导MCF-7细胞凋亡的发生流式细胞仪结果显示,25nM十字孢碱可以诱导MCF-7细胞的凋亡,而这种凋亡的发生是时间依赖性的,分别是：12h可以诱导13%的细胞凋亡,24h诱导17%的细胞凋亡,48h诱导34%的细胞凋亡(P<0.01)。4.十字孢碱可以诱导磷酸化Pak2的增强,以及Cleaved-Caspase-7的增多Western blotting结果显示,十字孢碱可以诱导磷酸化Pak2在1h逐渐增强,6h达到高峰,12h逐渐减弱。而在Pak2磷酸化减弱的同时,Cleaved-Caspase-7信号逐渐增强,因为磷酸化的Pak2和Cleaved-Caspase-7分别代表了它们的活性,提示了Pak2与Caspase-7之间存在着一定的调节关系。第二章Pak2在细胞内能与Caspase-7共定位并相互作用方法1.将pc-DNA3.1-V5-pak2和pCMV-Myc-caspase-7在293细胞中过表达,免疫共沉淀检测Pak2与Caspase-7的结合情况。2.免疫共沉淀检测内源性Pak2与Caspase-7的结合情况。3.免疫荧光检测Pak2与Caspase-7的细胞内定位,实验分为十字孢碱刺激组和不刺激组。4.体外激酶反应实验检测Pak2能否磷酸化Caspase-7。结果1.过表达的Pak2能够与Caspase-7在293细胞里结合在293细胞里过表达pc-DNA3.1-V5-Pak2和pCMV-Myc-Caspase-7, Western blotting检测V5和Myc标签,结果显示过表达情况很好,然后免疫共沉淀293细胞中的V5标签,Western blotting检测Myc,实验结果显示相比较只表达pCMV-Myc-Caspase-7组,在同时过表达pc-DNA3.1-V5-Pak2和pCMV-Myc-Caspase-7组,Myc有较强的表达,说明过表达的Pak2能与Caspase-7在293细胞里结合。2.内源性Pak2能与Caspase-7在MCF-7细胞里结合在MCF-7细胞裂解物中,免疫共沉淀Pak2, Western blotting检测Caspase-7,结果显示内源性Pak2能与Caspase-7结合。3.Pak2能与Caspase-7在MCF-7细胞里共定位免疫荧光结果显示,在正常的MCF-7细胞里,Pak2与Caspase-7能够同时出现在细胞核和细胞质中,而在经过十字孢碱刺激的MCF-7细胞里,Pak2与Caspase-7共同定位于细胞核中。4.Pak2能在体外磷酸化Caspase-7体外激酶反应实验用活化的Pak2与Caspase-7共反应,用Pak2已知的磷酸化底物Histone H4作为阳性对照。磷32放射自显影结果显示,相比较Pak2和Histone H4组,Pak2和Caspase-7组出现了很强的磷酸化信号,提示了活化的Pak2能够在体外磷酸化Caspase-7。第三章Pak2能够磷酸化Caspase-7在丝氨酸和苏氨酸位点方法1.体外激酶反应实验用活化的Pak2磷酸化Caspase-7, Western blotting检测p-Serine和p-Threonine,来确定可能的磷酸化位点。2.用Netphos2.0(?)软件预测Caspase-7潜在的磷酸化化点。3.合成11个含有潜在被磷酸化的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点的肽链,然后用体外激酶反应实验确定哪个位点可以被Pak2磷酸化。4.在确定磷酸化位点后,将这些位点突变,表达和纯化突变的Caspase-7蛋白,和野生型Caspase-7蛋白同时做体外激酶反应实验,来判断找到的磷酸化位点的正确与否。结果1.Pak2可以同时磷酸化Caspase-7在丝氨酸和苏氨酸位点Pak2和Caspase-7体外激酶反应实验之后,Western blotting检测p-Serine和p-Threonine,实验结果显示,与只有Pak2组相比较,Pak2和Caspase-7组苏氨酸和丝氨酸磷酸化信号均显著增强,又因为Pak2是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,提示Pak2可能既能磷酸化Caspase-7在苏氨酸位点,又能磷酸化其在丝氨酸位点。2. Caspase-7有7个潜在的丝氨酸磷酸化位点和4个潜在的苏氨酸磷酸化位点Netphos2.0软件预测结果显示,Caspase-7有7个潜在的丝氨酸磷酸化位点和4个潜在的苏氨酸磷酸化位点会被Pak2磷酸化。其中,分值越高,说明这个位点被磷酸化的可能性越大。3.Pak2可能磷酸化Caspase-7在丝氨酸30,239和苏氨酸173位点根据上步预测的结果,合成了11个肽链,分别与Pak2进行体外激酶反应实验,结果显示,肽链1,6,10与其他8个肽链相比有很强的磷酸化信号,提示丝氨酸30,丝氨酸239和苏氨酸173位点是最有可能被Pak2磷酸化的位点。4.突变的Caspase-7蛋白被Pak2磷酸化的信号比野生型Caspase-7明显下降将预测的丝氨酸30,丝氨酸239和苏氨酸173位点突变为丙氨酸,表达和纯化突变的Caspase-7蛋白,体外激酶反应实验结果显示,与野生型Caspase-7相比,三个位点突变的Caspase-7蛋白被Pak2磷酸化的信号明显下降,提示丝氨酸30,丝氨酸239和苏氨酸173位点是Caspase-7最有可能被Pak2磷酸化的位点。第四章Pak2在体外抑制Caspase-7的活性方法1.体外激酶反应实验首先用活化的Pak2磷酸化野生型Caspase-7,然后用Caspase-3活性测定试剂盒检测Caspase-7的活性。因为Caspase-3与Caspase-7有着共同的底物,所以Caspase-3活性测定试剂盒也可以用来检测Caspase-7的活性。2.体外激酶反应实验首先用活化的Pak2磷酸化突变型Caspase-7,然后用Caspase-3活性测定试剂盒检测突变型Caspase-7的活性。3.体外激酶反应实验首先用活化的Pak2分别磷酸化野生型Caspase-7和突变型Caspase-7,然后将反应物与活化的Caspase-8再反应,Western blotting检测全长的Caspase-7,被Caspase-8切割的Caspase-7大亚基以及去掉N端肽段的AN-Caspase-7。结果1.Pak2在体外抑制野生型Caspase-7的活性Caspase-3活性测定试剂盒结果显示,野生型Caspase-7本身在405nm的吸光值在90min时达到0.24nm/μg,而在Pak2磷酸化Caspase-7之后,野生型Caspase-7在405nm的吸光值在90min时只有0.05 nm/μg,与Caspase-7本身的活性相比,被Pak2磷酸化,Caspase-7的活性被抑制了4倍多(P<0.01)。2.Pak2在体外不能抑制突变型Caspase-7的活性Caspase-3活性测定试剂盒结果显示,突变型Caspase-7本身在405nm的吸光值在2h时到达0.19nm/μg,而在Pak2磷酸化Zaspase-7之后,突变型Caspase-7在405nm的吸光值在2h时仍然有0.15 nm/μg,与突变型Caspase-7本身的活性相比,被Pak2磷酸化,突变型Caspase-7的活性不被明显抑制(P>0.05)。3.Pak2磷酸化Caspase-7之后,能够抑制其被Caspase-8的切割体外激酶反应实验首先用活化的Pak2分别磷酸化野生型Caspase-7和突变型Caspase-7,然后将反应物与活化的Caspase-8再反应,Western blotting结果显示,野生型的Caspase-7被Pak2磷酸化后,Caspase-7大亚基和去除N端肽段的ΔN-Caspase-7的信号与Caspase-7本身相比明显减弱,而突变型的Caspase-7因为不能被Pak2磷酸化,所以其大亚基和去除N端肽段的ΔN-Caspase-7的信号与突变型Caspase-7本身相比并没有明显下降。提示Pak2能磷酸化Caspase-7,并抑制其被Caspase-8切割,但是突变型Caspase-7却几乎不受其影响,反向证明了三个磷酸化位点的正确性。第五章下调Pak2的表达能够促进MCF-7乳腺癌细胞凋亡的增加方法1.利用针对Pak2的shRNA,包装出逆转录病毒颗粒,感染MCF-7细胞,从而下调Pak2的表达。同时用shGFP包装出的逆转录病毒颗粒感染MCF-7作为阴性对照。Western blotting检测不同shRNA对Pak下调的效果,用β-actin作为上样对照。2.用不同浓度十字孢碱分别处理shmockMCF-7和shPak2MCF-7细胞,流式细胞仪检测两组细胞凋亡的情况。3.用十字孢碱分别处理shmockMCF-7和shPak2MCF-7细胞,Western blotting检测Pak2, cleaved- Caspase-7, cleaved-PARP和β-actin的表达。4. Caspase-3活性测定试剂盒检测shmockMCF-7和shPak2MCF-7细胞中Caspase-7的活性,实验分为十字孢碱刺激组和不刺激组。结果1.用shPak2 #1和shPak2 #2包装的逆转录病毒能成功下调MCF-7细胞中的Pak2表达Western blotting结果显示,用shPak2#1和shPak2#2包装的逆转录病毒感染MCF-7细胞,Pak2表达水平与对照组相比明显下降,其中shPak2 #2效果要好于shPak2#1,β-actin作为上样对照。2. shPak2MCF-7细胞组凋亡明显高于shmockMCF-7细胞组流式细胞结果显示,25nM十字孢碱24h能引起shmockMCF-7细胞组7%的凋亡发生和shPak2MCF-7细胞组14%的凋亡发生；而50nM十字孢碱24h则能引起shmockMCF-7细胞组14%的凋亡发生和shPak2MCF-7细胞组27%的凋亡发生,与shmockMCF-7细胞组相比较,十字孢碱能引起shPak2MCF-7细胞组明显的凋亡增加(P<0.01),并且这个凋亡的发生是呈浓度依赖性的。3. shPak2MCF-7细胞组cleaved- Caspase-7明显高于shmockMCF-7细胞组用100nM十字孢碱处理shmockMCF-7和shPak2MCF-7细胞于不同的时间点,Western blotting结果显示与shmockMCF-7细胞组相比较,100nM十字孢碱能引起shPak2 MCF-7细胞组cleaved- Caspase-7以及Caspase-7的底物cleaved-PARP信号均明显地增强。4. shPak2MCF-7细胞组Caspase-7的活性明显强于shmockMCF-7组用100nM十字孢碱处理细胞4h,Caspase-3活性测定试剂盒检测结果显不,shmockMCF-7细胞组Caspase-7(?)活性在405nm的吸光值为0.92nm/μg,而shPak2 MCF-7细胞组Caspase-7(?)舌性在405nm的吸光值为1.7nm/μg,与shmockMCF-7细胞组相比,shPak2MCF-7细胞组Caspase-7活性明显增强(P<0.01)。第六章下调Pak2的表达能够促进其他乳腺癌细胞凋亡的增加方法1.利用针对Pak2的shRNA#2,包装出逆转录病毒颗粒,感染SK-BR-3和MDA-MB-468乳腺癌细胞,从而下调Pak2的表达。同时用shGFP包装出的逆转录病毒颗粒感染SK-Br-3和MDA-MB-468作为阴性对照。Western blotting检测shRNA对Pak下调的效果,(3-actin作为上样对照。2.用不同浓度十字孢碱分别处理shmock SK-BR-3, shPak2 SK-BR-3细胞和shmock MDA-MB-468, shPak2 MDA-MB-468细胞,流式细胞仪检测两组细胞凋亡发生的情况。3.用十字孢碱分别处理shmock SK-BR-3, shPak2 SK-BR-3细胞和shmock MDA-MB-468, shPak2 MDA-MB-468细胞,Western blotting检测Pak2,cleaved-Caspase-7, cleaved-PARP和β-actin(?)的表达。4.用阿霉素分别处理shmockMCF-7, shPak2MCF-7细胞,shmockSK-BR-3, shPak2SK-BR-3细胞和shmockMDA-MB-468,shPak2MDA:2MDA-MB-468细胞,Western blotting检测Pak2, cleaved- Caspase-7和β-actin(?)的表达。结果1. shPak2#2能成功下调SK-BR-3和MDA-MB-468细胞中的Pak2表达Western blotting结果显示,用shPak2 #2包装的逆转录病毒感染SK-BR-3和MDA-MB-468细胞,Pak2表达水平与对照组相比明显下降。2. shPak2细胞组凋亡明显高于shmock细胞组流式细胞结果显示,25nM十字孢碱24h能引起shmockSK-BR-3细胞组11%的细胞凋亡和shPak2SK-BR-3细胞组23%的细胞凋亡；而25nM十字孢碱24h则能引起shmockMDA-MB-468细胞组26%的细胞凋亡和shPak2MDA-MB-468细胞组47%的细胞凋亡发生,与shmock细胞组相比较,十字孢碱能引起shPak2细胞组明显的凋亡增加(P<0.01),并且这个凋亡的发生是呈浓度依赖性的。3.在十字孢碱处理下,shPak2细胞组cleaved- Caspase-7明显多于shmock细胞组Western blotting结果显示与shmock SK-BR-3细胞组相比较,100nM十字孢碱能引起shPak2SK-BR-3细胞组cleaved-Caspase-7以及Caspase-7的底物cleaved- PARP信号均明显地增强。与shmock MDA-MB-468细胞组相比较,100nM十字孢碱也能引起shPak2MDA-MB-468细胞组cleaved-Caspase-7以及Caspase-7的底物cleaved- PARP均明显的增加。4.在阿霉素处理下,shPak2细胞组cleaved-Caspase-7月显多于shmock细胞组用5μM阿霉素处理shmock细胞和shPak2细胞于不同的时间点,Western blotting结果显示与shmock细胞组相比较,5μM阿霉素同样能引起shPak2细胞组cleaved- Caspase-7信号明显地增强。结论1、相比较癌旁正常组织和正常乳腺上皮细胞,Pak2在人乳腺癌组织和乳腺癌细胞中高表达。高表达的Pak2在细胞内能与Caspase-7共定位,并且磷酸化Caspase-7在丝氨酸30,239和苏氨酸173位点。磷酸化的Caspase-7的活性下降,进而抑制了化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡2.下调Pak2基因在乳腺癌细胞里的表达,可以引起Caspase-7被切割的增多和活性的增强以及乳腺癌细胞凋亡的增加,提示Pak2引起的乳腺癌细胞对化疗药物的耐药是通过抑制Caspase-7(?)舌性而实现的,为Pak2成为乳腺癌治疗的新的靶标提供了实验基础。