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脑梗死是神经内科的常见病及多发病,具有高发病率及高致残率的特点,严重影响患者的生活质量。动脉粥样硬化是脑梗死的最常见病因。血管内治疗是目前临床上治疗脑梗死的常用方法,但血管内治疗导致的血管内皮损伤引起的再狭窄会影响患者的预后。血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化形成的起始因素之一,也是血管内治疗后再狭窄的主要原因。许多因素可导致血管内皮细胞损伤,如高血糖、高血压、炎症、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及机械损伤等。血管内治疗对于血管内皮的损伤属于机械性损伤,并且血管损伤部位伴随着活性氧的增加,从而加重了血管内皮细胞损伤的程度。在脑梗死的急性期,内皮细胞开始增生,随后大量的毛细血管开始生成,新生血管的形成可改善脑供血从而促进患者神经功能的恢复,其中血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)与内皮细胞增殖和血管生成密切相关。综上所述,脑梗死的发生发展与血管内皮的关系十分密切。截至目前,血管内皮损伤的具体机制尚未完全清楚,因此,深入研究血管内皮损伤的机制以及如何保护血管内皮细胞对于脑梗死的防治具有重要意义。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Proline-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)是一种钙依赖性酪氨酸激酶,有研究表明Pyk2参与了由炎症和糖尿病等因素引起的内皮损伤过程,并且球囊损伤可导致Pyk2被激活,而阻断Pyk2可减少内膜增生。线粒体钙离子单向转运体(Mitochondrial calcium uniport,MCU)作为线粒体钙摄取系统的核心成分,可调节线粒体的钙稳态和细胞凋亡。血管内皮的屏障作用是血管内皮的生理功能之一,既往有研究表明抑制MCU可以保护血管内皮的屏障作用,说明MCU与血管内皮之间存在一定的关联。我们之前的研究表明,在心肌细胞中,磷酸化Pyk2可以激活MCU,导致线粒体钙超载,并启动凋亡信号转导。但血管内皮细胞损伤与Pyk2/MCU通路之间的关系尚不明确。激肽在血管内皮功能中起重要作用。尤瑞克林是一种组织激肽释放酶,可以分解不活跃的低分子量激肽原,释放血管活性激肽,激肽在血管内皮与缓激肽受体结合,从而触发瀑布式的生物效应,包括抑制血小板粘附和聚集,促进NO分泌增加、血管舒张和血流量增加。在临床上,尤瑞克林被广泛用于脑梗死的治疗,并且有研究表明尤瑞克林可能是预防血管内治疗术后再狭窄的一种潜在治疗药物,但尤瑞克林与血管内皮损伤之间的潜在分子机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨Pyk2/MCU通路是否参与血管内皮细胞损伤的过程,尤瑞克林是否能通过抑制Pyk2/MCU通路保护血管内皮细胞以及尤瑞克林是否能通过调节血管内皮功能而促进脑梗死患者的神经功能恢复。本研究首先建立了雄性Sprague-Dawley大鼠颈动脉球囊损伤模型,以探讨Pyk2/MCU通路是否参与了球囊损伤导致的血管内皮损伤过程,以及尤瑞克林是否通过抑制Pyk2/MCU通路而发挥保护血管内皮细胞的作用。由于球囊损伤导致的血管损伤部位伴随着活性氧的增加,因此本研究在体外建立了血管内皮细胞的氧化损伤模型,旨在进一步探讨Pyk2/MCU通路是否参与了氧化损伤导致的血管内皮损伤过程以及尤瑞克林对血管内皮细胞的保护机制。然后本研究对河北医科大学第二医院神经内科收治的急性脑梗死患者进行了血清VEGF水平的检测,以探讨尤瑞克林对脑梗死后血管内皮功能的作用。这项研究旨在探讨尤瑞克林对血管内皮损伤的作用及机制,分为以下三部分,各部分内容概述如下。第一部分尤瑞克林通过抑制Pyk2/MCU通路减轻球囊损伤导致的大鼠血管内皮损伤目的:探讨Pyk2/MCU通路是否参与了球囊损伤导致的血管内皮损伤过程,以及尤瑞克林是否通过抑制Pyk2/MCU通路而发挥内皮细胞保护作用。方法:建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。大鼠被随机分成5个组:对照组,假手术组,球囊损伤组,尤瑞克林(0.00875 PNA/kg/天)+球囊损伤组,尤瑞克林(0.0175 PNA/kg/天)+球囊损伤组。分别在球囊损伤后第7天和第14天通过苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)法观察各组颈总动脉内膜增生情况;通过透射电子显微镜(Transmis sion e-lectron microscope,TEM)观察各组动脉内皮细胞的超微结构变化;并且在球囊损伤后第14天通过蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)法检测各组颈总动脉Pyk2、MCU及血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endoth-elial cell adhesion molecule-1,CD31)的蛋白表达情况。结果:1.在球囊损伤后第7天和第14天,本研究观察到球囊损伤组的颈总动脉内膜不均匀增厚,新生内膜形成及管腔变窄,并且在第14天这种改变更为明显。然而,尤瑞克林治疗后第14天新生内膜的形成和管腔狭窄程度显著减轻,但在尤瑞克林治疗后第7天没有明显变化,并且两种剂量的尤瑞克林之间没有显著差异。2.通过透射电镜观察,本研究发现对照组和假手术组的内皮细胞超微结构正常,胞饮小泡数量较多。损伤组与对照组和假手术组相比,内皮细胞超微结构发生显著变化,细胞表面断裂且不均匀,伴有胞饮小泡减少甚至消失,内质网扩张,线粒体肿胀,而且这些变化在球囊损伤后第14天尤为明显。然而,应用尤瑞克林治疗后第14天,球囊损伤诱导的内皮细胞超微结构变化显著减轻,但在治疗后第7天没有明显变化。并且,高剂量的尤瑞克林治疗效果更加明显。3.球囊损伤后第14天,颈总动脉中Pyk2、MCU和CD31的蛋白表达水平在对照组和假手术组之间没有显著差异。然而,与假手术组相比,球囊损伤组Pyk2、MCU和CD31的蛋白表达显著增加。与球囊损伤组相比,尤瑞克林治疗降低了Pyk2、MCU和CD31的蛋白表达,但两种剂量之间没有显著差异。第二部分尤瑞克林通过抑制Pyk2/MCU通路减轻过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤目的:探讨Pyk2/MCU通路是否参与了氧化损伤导致的血管内皮损伤过程,以及尤瑞克林对血管内皮细胞的保护机制。方法:建立过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化损伤模型,通过MTS法检测细胞活力,观察尤瑞克林对H2O2诱导的HUVECs细胞活力损伤的影响,以及其作用机制。将培养的HUVECs同步化24小时后分为4组,分别为对照组,H2O2模型组,尤瑞克林(0.25 PNA/L)+H2O2组,尤瑞克林(0.5P-NA/L)+H2O2组。通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorb-nent Assay,ELISA)检测血管紧张素Ⅱ(AngiopoietinⅡ,AngⅡ)含量,通过流式细胞术检测细胞内ROS水平、线粒体膜电位、细胞内游离钙水平和凋亡细胞,通过TEM观察HUVECs的超微结构,通过Western Blot实验观察Pyk2、MCU和Caspase-3的蛋白表达,并通过实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time reverse transcription-quantitative Polymerase C-hain Reaction,RT-q PCR)检测Pyk2和MCU的m RNA表达。另外利用短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)技术抑制HUVECs中Pyk2的表达,得到Pyk2低表达细胞,并再次应用H2O2及尤瑞克林处理细胞,通过MTS法观察细胞活力、流式细胞术观察细胞内游离钙水平、Western Blot实验观察Pyk2、MCU和Caspase-3的蛋白表达。结果:1.尤瑞克林部分通过缓激肽B2受体(bradykinin B2 receptor,B2R)减轻H2O2引起的HUVECs活力下降,并抑制H2O2诱导的细胞内AngⅡ和ROS的过度产生,从而保护血管内皮细胞。2.尤瑞克林抑制H2O2诱导的HUVECs凋亡和细胞内游离钙超载,减轻内皮细胞线粒体损伤,并保护HUVECs的超微结构。3.尤瑞克林抑制H2O2诱导的HUVECs中Pyk2/MCU通路的激活。4.Pyk2低表达抑制H2O2诱导的HUVECs死亡、细胞内游离钙超载和MCU的蛋白表达上调。第三部分尤瑞克林对急性脑梗死患者血清VEGF水平的影响目的:观察尤瑞克林治疗对急性脑梗死患者血清VEGF水平的影响,探讨尤瑞克林对脑梗死后血管内皮功能的作用。方法:纳入2017年07月-2018年12月在河北医科大学第二医院神经内科住院的急性脑梗死患者42例,随机分成两组,实验组在给予基于指南的标准治疗基础上同时给予尤瑞克林,对照组只给予基于指南的标准治疗,两组均治疗14±5天。收集患者的临床信息,并在治疗前及治疗后第14±5天对患者进行神经功能评定,采用ELISA法检测患者血清中VE GF的水平。结果:1.实验组和对照组临床基线资料比较无显著差异(P>0.05)。2.实验组患者治疗后第14±5天,NIHSS评分、BI指数与治疗前相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组患者治疗后第14±5天,N-IHSS评分与治疗前相比,差异具有统计学意义(P<0.05),而BI指数与治疗前相比,差异无明显统计学意义(P>0.05)。治疗后第14±5天实验组与对照组的NIHSS评分差值相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.两组患者治疗前血清中VEGF水平比较无显著差异(P>0.05)。实验组治疗后第14±5天血清中VEGF的水平同治疗前相比,差异具有统计学意义(P<0.05),而对照组治疗后第14±5天血清中VEGF的水平同治疗前相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.Pyk2/MCU通路参与了球囊损伤导致的大鼠颈总动脉内皮损伤的过程,尤瑞克林能够通过抑制Pyk2/MCU通路减轻球囊损伤导致的内膜增生,防止血管内治疗术后再狭窄。2.Pyk2/MCU通路在H2O2诱导的血管内皮细胞损伤中被激活。Pyk2低表达可减轻H2O2诱导的血管内皮细胞损伤。尤瑞克林通过抑制Pyk2/MCU通路,减轻H2O2诱导的细胞凋亡和线粒体损伤,保护血管内皮细胞。3.尤瑞克林可通过调节急性脑梗死患者的血清VEGF水平,改善血管内皮功能,促进急性脑梗死患者的神经功能恢复。