上个世纪90年代兴起了基因组、转录组、蛋白组和代谢组等组学的研究，系统生物学试图综合分析这些组学的数据并建立模型，而合成生物学以系统生物学为基础，同时引进工程技术的概念，主张从头组建标准部件进行生物学功能阐述和应用。链霉菌产生自然界目前已知约60％的抗生素和药理活性物质，是抗生素的主要工业生产菌。在模式链霉菌——天蓝色链霉菌中虽然已建立了基因组和抗生素生物合成改造的遗传操作系统，但是，相比于其它模式微生物（如大肠杆菌和酿酒酵母）仍不够完善。本论文中拟利用合成生物学的方法，尝试改进天蓝色链霉菌的基因组操作系统，同时对重要的抗生素（如多拉菌素、埃博霉素）的组份进行改造和异源重构。具体内容如下：　　 天蓝色链霉菌中的基因同源重组效率不高。为了促进同源重组事件的发生，在天蓝色链霉菌中引进了一个酿酒酵母来源的稀有内切酶I-sce I(命名为sceS)，该酶识别18bp的非对称序列，可以在天蓝色链霉菌染色体上引入DSB(DNA双链断裂)，激发宿主自身的重组修复系统。具体过程如下：依据天蓝色链霉菌的密码子使用情况，优化和合成了sceS，并将该基因置于硫链丝菌素诱导的启动子tipA下。通过tipA诱导的sceS表达。以敲除天蓝色链霉菌中放线紫红素生物合成基因簇为例，当同源重组交换臂仅为lkb时，仍可以发生高频率的同源重组，甚至可以直接筛选到发生双交换的克隆子（约为10%），整个过程仅需要2-3周时间即可利用sceS介导的方法在天蓝色链霉菌中成功地实现了放线紫红素生物合成基因簇大片段的、无疤痕的精确敲除。相比传统方法（交换臂大于3kb，效率低）和PCR targeting（效率5%，流程长，相对耗时，有疤痕）具有一定的优势。　　 在天蓝色链霉菌中，recA基因介导的同源重组是主要的重组修复系统，但是效率较低。在大肠杆菌中，λ噬菌体redET介导很高效率的同源重组（同源交换臂的长度仅需要39bp），bet是redET系统中促进单链DNA与目标靶DNA进行同源重组的基因，而形成单链DNA是原核和真核生物的同源重组事件中的一个关键的步骤。本实验中，选择链霉菌优化的密码子，在链霉菌中合成了大肠杆菌来源的recA基因和久噬菌体的bet基因。通过将recA基因和合成优化过的I-see I基因导入天蓝色链霉菌进行共同表达，分别选用tipA和天蓝色链霉菌recA启动子进行表达，实验重复3次，考察了两个基因同时表达对天蓝色链霉菌的敲除系统效率的影响，结果表明没有较单基因(sceS)有明显的效率改进。优化后的bet基因将用于改进天蓝色链霉菌重组效率的进一步研究。　　 阿维菌素是主要的生物兽药，而多拉菌素是其衍生的第三代基因工程药物，是目前效果最好、毒性最低的抗寄生虫药物。由于除虫链霉菌在产生多拉菌素的同时常常也产生阿维菌素，造成了工业生产上提纯多拉菌素的困难（产生10个结构类似物，包括8个阿维菌素组份，2个多拉菌素类产物）。研究表明aveD、bkdF是控制阿维菌素类产物相关基因，而aveC则是多拉菌素合成的组份控制基因。合成了带有12个位点突变的aveC*，导入缺失了aveD和bkdF的多拉菌素产生菌中，将原aveC基因用突变的aveC*进行原位置换。发酵实验表明，多拉菌素的纯度从34.2%提高到69.1%，方便了下游提取。　　 随着合成生物学的飞速发展，2006和2010年分别实现了利用微生物生产药用植物产生的青蒿酸和紫杉醇前体。埃博霉素是重要的天然抗癌药物，其抗癌作用机理与紫杉醇类似。但是埃博霉素的天然产生菌——纤维堆囊菌培养困难、生长非常缓慢。我们拟利用合成生物学的方法，在天蓝色链霉菌中重构埃博霉素生物合成基因簇。利用Biobrick方法，拟在埃博霉素合成基因簇中的每个基因前面加入链霉菌中高表达的红霉素启动子ermE。已构建了4个质粒(pKS-EABC，pKS-EFK，pKS-D，pKS-E)，含有埃博霉素所有合成基因，其中pKS-EABC带有分别加上ermE启动子的epoA、epoB、epoC，pKS-EFK带有分别加上ermE启动子的epoE和epoK，pKS-D和pKS-E分别带有酶切得到的完整的epoD和epoE序列。　　 天蓝色链霉菌作为链霉菌中的模式菌株，遗传、发育和次级代谢研究都相对深入。特别在基因组测序完成之后，很多次级代谢产物合成基因簇功能未知。在对天蓝色链霉菌一个新的肽类生物合成基因簇（sc06429-sco6438）的功能研究中，首先采用RT-PCR验证了基因簇的串联表达，经过基因簇内的敲除发现，缺失基因sco6429-sc06431和单独缺失sc06431可以显著延缓和减少孢子的产生，而缺失全基因簇的突变株没有明确表型。表明导致以上表型的基因可能为sc06432-sco6438。同时采用红霉素启动子整合表达NRPS合成酶编码基因sco6432也可以导致除虫链霉菌MMR8165产生孢子明显减少，与天蓝色链霉菌突变体表型相似。推测该基因的过表达可能影响除虫链霉菌的生长。　　 综上所述，利用合成生物学的方法，改进了天蓝色链霉菌的基因组同源重组系统，完成了多拉菌素的组份优化，初步重构了埃博霉素生物合成基因簇，以及初步研究了一个新的肽类生物合成基因簇。希望未来在链霉菌宿主遗传改造和重要经济价值的抗生素的改造和异源表达等方面，更多地运用合成生物学技术手段，为创新基因组技术和微生物产业应用提供支撑。