激素是生物界中普遍存在的微量但对生命活动有显著调节作用的一类物质。雌激素是一种甾类物质属于雌性激素,主要包括雌二醇（E2）、雌酮（E）和雌三醇（E3）三种。其中β-雌二醇是雌激素的代表物质,活性最高,围绕其开展的研究也最为广泛和深入。在脊椎动物中,雌激素的生物学功能是通过其受体的介导来实现的,经典的作用机制是雌激素激活雌激素受体并与之结合,随后受体二聚化与目标基因启动子上的雌激素应答元件结合调节目标基因的转录,进而影响脊椎动物的生长发育、繁殖及代谢。事实上,自性激素在高等动物中发现后不久,就陆续有研究报道包括昆虫在内的某些无脊椎动物组织或个体提取物中也有典型的高等动物甾类性激素存在,并具有一定的生理功能。家蚕是研究鳞翅目昆虫的模式生物,家蚕中有关雌激素的研究也已开展,但远不如脊椎动物中的研究深入。已经明确家蚕卵巢中含有且能代谢雌激素,蚕蛹粉提取物能对脊椎动物产生典型的雌激素效应:切除卵巢的小鼠用蚕蛹粉提取物灌胃,能恢复和缓解因卵巢切除导致的子宫重量下降,血液中雌激素含量降低的症状;且雌激素能对家蚕丝腺、脂肪体等组织的生理功能产生一定的影响,研究发现家蚕后部丝腺中有特异结合雌激素的蛋白。但2003年果蝇基因组测序完成发现昆虫中没有雌激素受体,也就是说雌激素在家蚕中发挥作用的机制并不清楚。雌激素在脊椎卵生动物中最典型的功能是与雌激素受体结合,然后通过雌激素受体（ER）识别卵黄原蛋白基因（Vg）启动子上的雌激素受体应答元件（ERE）调节Vg表达,在一定程度上可以使雄鱼体内的Vg含量达到与雌鱼当量的水平。家蚕作为卵生动物的一种,同样含有卵黄原蛋白。家蚕卵黄原蛋白（BmVg）主要在雌性家蚕化蛹蜕皮前后的脂肪体中合成,然后分泌到血淋巴中被正在发育的卵母细胞吸收作为将来胚胎发育的营养物质贮存。昆虫虽然没有雌激素受体,但有关于雌激素相关受体（ERR）的报道。脊椎动物中ERR可以通过与ER竞争辅因子或者启动子上的ERE参与雌激素的信号通路。本研究从检测家蚕血淋巴中的E2入手,以分析E2对Bm Vg基因的调控为基础,结合家蚕中的ERR探讨E2在家蚕中是否具有生物学功能及其在家蚕中发挥功能的分子机制。获得的主要研究结果如下:1.家蚕具有一定合成雌激素的能力前人研究发现家蚕的卵巢中含有E2,本文通过HPLC在家蚕血液中也检测到了E2,浓度为145.35 pg/mL。家蚕是开放性血液循环系统,E2如果在家蚕中发挥功能要经过血液的运输,暗示E2在家蚕中是有生理功能的。虽然包括家蚕在内的许多昆虫都检测到E2的存在,但目前对在昆虫中检出的E2来源并没有统一的看法,主流观点认为来自于食物。ELISA对停食后家蚕血淋巴中的E2含量检测发现,血淋巴中E2含量在家蚕化蛹蜕皮前的雌雄中稍有不同但差异不大,但在上蔟后36h左右有一个滴度高峰,随后开始下降到先前水平,直到化蛹后又开始上升。处于检测时期的家蚕已经没有进食,说明家蚕具有合成E2的能力。2.雌激素可以调控Bm Vg基因的表达RT-PCR和q RT-PCR检测发现Bm Vg这一雌特异高量表达的蛋白在雄性家蚕中也有微量的表达,且表达趋势与在雌性中一致:从上蔟第二天开始高量表达,到化蛹前达到高峰,随后开始下降。q RT-PCR显示雌性家蚕脂肪体中Bm Vg表达量的最大值大约是雄性家蚕脂肪体中的130倍。5nmol/g的蜕皮激素（20E）可以上调雌性和雄性家蚕脂肪体中Bm Vg的表达,增加雌性家蚕卵中卵黄磷蛋白的含量进而增加蚕卵的重量。20E对雌性家蚕Bm Vg表达的促进可以被20E受体抑制剂（虫酰肼,RH-5992）抑制。移植的卵巢和与20E等量的E2（5nmol/g）可以诱导雄性家蚕脂肪体中BmVg的表达。卵巢原基可以在雄性家蚕血淋巴中发育成卵,对其中的总蛋白进行SDS-PAGE,用硝酸银染色发现其可见蛋白的种类与在雌性家蚕中发育成的卵没有明显区别。并且在雄蚕中发育成的卵能检测到卵黄磷蛋白的存在。5nmol/g的E2抑制雌性家蚕脂肪体中Bm Vg的转录,摘除雌性家蚕卵巢原基,其血淋巴中BmVg蛋白积累脂肪体中Bm Vg基因转录上调。将从化蛹第2、3天的雌蚕血液中纯化出的BmVg蛋白注射到雌蚕血淋巴中,其脂肪体中Bm Vg基因的表达与对照相比没有发生显著改变。但过早（上蔟后36h）出现在雌蚕血液中的BmVg蛋白会被降解,只有当内源BmVg存在的情况下注射到家蚕血淋巴中的BmVg蛋白才能被卵巢吸收,并增加其卵中卵黄磷蛋白的含量,这可能与卵巢的发育程度有关。另外,添食E2和20E都可以促进家蚕上蔟,但雄性家蚕对20E更加敏感,2nmol/g、5nmol/g的20E连续添食可以将雄性家蚕上蔟的时间提前24h,10nmol/g的20E连续添食则只能使雄蚕提前12h上蔟;2nmol/g、5nmol/g、10nmol/g的E2和20E连续添食均能使雌性家蚕的上蔟提前12h。3.Bm Vg启动子上参与响应雌激素的元件可抑制其活性将报道能使外源基因在家蚕中表现出完整内源Bm Vg特性,长798bp的Bm Vg启动子在JASPAR网站上扫描,得到10条与脊椎动物启动子上参与雌激素应答的元件类似的核苷酸序列。结合已有文献和信息分析,在Bm Vg启动子上选定两条可能与Bm Vg启动子参与E2应答相关的核苷酸序列ERRE like 1和ERRE like2。构建截短（去掉ERRE like 1）和突变（ERRE like 2）的Bm Vg启动子驱动荧光素酶表达的细胞转染载体,转染BmE细胞测定酶活发现在Bm E细胞中Bm Vg启动子上的这两个元件都能抑制Bm Vg启动子的活性。转染后的细胞经10-6M的E2处理能进一步抑制含有这两个元件的Bm Vg启动子活性。其中ERRE like 1对Bm Vg启动子活性的抑制作用比ERRE like 2更为明显。EMSA实验发现在BmE细胞和雌性家蚕脂肪体的核蛋白中均有特异结合Bm Vg启动子上ERRE like 1和ERRE like 2元件的转录因子。4.家蚕中雌激素相关受体基因的分子特征以家蚕卵巢转录组测序为基础,采用PCR技术克隆得到两种拼接形式的家蚕雌激素相关受体（Bm ERR）的核苷酸序列:短型BmERR比长型Bm ERR多21个碱基;其中长型ERR为家蚕卵巢中ERR的主体形式,长型ERR基因c DNA序列全长1296 bp,编码431个氨基酸残基,起始密码ATG终止密码TAA。Blast比对证实Bm ERR与其它昆虫ERR保守结构域的氨基酸序列具有很高的一致性,BmERR具有ERR蛋白家族典型的结构特征。系统进化分析显示相对于其它报道的昆虫ERR核苷酸序列,家蚕ERR的进化地位最为原始。5.Bm ERR可以和Bm Vg启动子上参与其响应雌激素的元件结合将Bm ERR的DNA结合结构域克隆到p ET 28a载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化出的活性蛋白与生物素标记的ERRE like 1和ERRE like 2探针孵育后,通过EMSA实验发现与ERRE like 1探针孵育过后的Bm ERR能在膜上检测到清晰的特异滞后条带,说明ERRE like 1可以特异的结合Bm ERR,但ERRE like 2在体外不与BmERR结合。说明在BmE细胞和雌性家蚕脂肪体核蛋白中与ERRE like 2元件结合的转录因子不是Bm ERR。因此,将ERRE like 1命名为ERRE。BmERR抗体的引入能减少BmE细胞和脂肪体中核蛋白与ERRE探针孵育后产生的滞后条带量,说明BmE细胞和脂肪体中结合ERRE元件的核蛋白中存在BmERR。进一步通过ChIP在活细胞中也证明了BmERR可以结合在BmVg启动子的ERRE元件上。6.过表达BmERR抑制Bm Vg启动子的活性将Bm ERR克隆到A4启动子驱动表达的细胞表达载体上,与含有ERRE元件的Bm Vg启动子驱动表达荧光素酶的细胞表达载体共转染细胞,发现在BmE细胞中,BmERR的增加能显著降低启动子活性。进一步将ERRE元件通过PCR的方式引入A4启动子,过表达BmERR可以降低改造后A4启动子驱动表达的红色荧光蛋白含量。另外,10-6M的E2能加剧Bm ERR对含有ERRE元件启动子的抑制作用。7.Bm ERR的表达受到雌激素的诱导PCR检测发现BmE细胞系中也有Bm ERR的表达,10-6M的E2能上调BmE细胞中Bm ERR的表达。利用RT-PCR检测雌性家蚕脂肪体中Bm ERR和BmVg的表达,发现这两个基因的表达表现出基本相反的趋势。5nmol/g的E2注射上蔟后48h的雌性家蚕,12h后BmERR的表达量开始上调,24h后脂肪体中的BmVg基因表达量与对照相比显著下调。对上蔟后家蚕精巢、卵巢中的ERR检测发现Bm ERR在家蚕生殖腺中的表达量无显著差异,但均在化蛹前后有一个表达高峰,而且与脂肪体中Bm Vg的表达趋势极为相似。8.BmERR可以通过参与BmEcR信号通路调节Bm Vg的表达BmEcR和BmUsp同时存在的情况下也能结合Bm Vg启动子上的ERRE元件,说明在家蚕中BmERR可以通过参与BmEcR信号通路发挥功能。虽然脊椎动物中E2通过ER发挥其生物学功能,但昆虫中是不存在ER的。微量热涌动实验（microscale thermophoresis,MST）初步证实在E2在家蚕中能与EcR结合,推测EcR在家蚕中可以作为E2的“受体”介导E2对家蚕生理进程的调控。综上所述,E2在家蚕中同样存在,且家蚕具有一定合成E2的能力。与脊椎卵生动物Vg一样,BmVg的表达也可以受到E2的调节。不同的是在家蚕中E2抑制雌性家蚕脂肪体中Bm Vg的转录。进一步的分析发现E2对雌性家蚕脂肪体中Bm Vg表达的抑制作用是通过诱导转录因子BmERR结合到BmVg启动子上的调控元件ERRE—5′ATCTAGGGTCACAG3′上实现的,脊椎动物ERR通过参与ER信号通路发挥功能,家蚕中没有ER,E2以EcR为“受体”诱导BmERR表达,然后BmERR通过参与EcR的信号通路调节BmVg表达。