论文部分内容阅读
目的:探讨竹节参总皂苷对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织炎症和棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导的脂肪细胞炎症的干预作用,并进一步研究其可能涉及的分子机制,以期为防治由高脂饮食引起的相关代谢性疾病提供新思路。方法:1、体内实验:以无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级BALB/c雄性小鼠为研究对象,随机将50只8周龄小鼠分为正常饮食组、高脂模型组、竹节参总皂苷低、中和高剂量组,每组10只,每只小鼠体重18-20 g。竹节参总皂苷低、中和高剂量组分别灌胃给予竹节参总皂苷30 mg/kg、90 mg/kg、150 mg/kg,其余组别分别灌胃给予相应的药物溶剂0.5%羧甲基纤维素钠,每周停药1天,持续给药4个月。给药期间正常饮食组小鼠给予正常饲料,其余组别小鼠分别给予高脂饲料,每组小鼠自由饮食。在给药喂养期间:(1)准确记录每只小鼠体重,并进行口服葡萄糖耐量试验;末次给药结束后麻醉处死小鼠,摘眼球取血,观察以下指标:(2)称取内脏脂肪组织重量,计算内脏脂肪指数;(3)生化检测试剂盒检测小鼠血清中葡萄糖、甘油三酯(Triglycerlide,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白-胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的含量;(4)苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察小鼠附睾脂肪组织病理变化;(5)实时定量PCR法检测小鼠脂肪组织相关炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的mRNA表达水平;(6)Western blot法检测小鼠脂肪组织相关炎症因子TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表达水平;(7)Western blot法检测小鼠脂肪组织核转录因子-κB(Nuclear transcription fatorκB,NF-κB)炎症通路中磷酸化核转录因子-κB(Phosphorylated nuclear transcription fatorκB,pNF-κB)、总NF-κB、磷酸化核转录因子-κB抑制蛋白(Phosphorylated nuclear factor-κB-inhibitorκB,pIκB)、总核转录因子-κB抑制蛋白(Nuclear factor-κB-inhibitorκB,IκB)的蛋白表达水平,并比较各组小鼠脂肪组织中相应蛋白磷酸化水平蛋白与总蛋白的比值变化;(8)实时定量PCR法检测小鼠脂肪组织中M1型巨噬细胞标志物F4/80、CD11b的mRNA表达水平;(9)流式细胞术检测各组小鼠附睾脂肪组织中巨噬细胞的比例。2、体外实验:(1)噻唑蓝(Ethylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法筛选竹节参总皂苷对3T3-L1前脂肪细胞的安全药物浓度;(2)运用传统的“鸡尾酒”法将3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞,油红O染色法检测成熟脂肪细胞是否分化成功;(3)将分化成功的成熟脂肪细胞用PA处理,在PA处理的同时加入不同浓度的竹节参总皂苷;(4)Western blot法检测各组细胞相关炎症因子TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表达水平;(5)Western blot法检测各组细胞NF-κB炎症通路相关蛋白pNF-κB/NF-κB、pIκB/IκB的表达水平。结果:1,体内实验:(1)成功建立小鼠肥胖模型,在小鼠的喂养过程中,各组小鼠的体重增长幅度差异明显,与正常饮食组比较,高脂模型组小鼠的体重从9周龄开始显著升高,有统计学差异(p<0.01);与高脂模型组比较,各用药组小鼠的体重增长速率在不同喂养阶段均明显降低(p<0.05或p<0.01)。(2)与正常饮食组比较,高脂模型组小鼠内脏脂肪指数显著升高(p<0.05),与高脂模型组比较,竹节参总皂苷处理后,各用药组小鼠内脏脂肪指数降低,且竹节参总皂苷高剂量组下降显著(p<0.01)。(3)各组小鼠给予葡萄糖0.5小时(Hour,h)后,血糖值相对于空腹血糖值均明显升高;其中,高脂模型组小鼠的血糖值明显高于正常饮食组(p<0.01),而各用药组的血糖值与高脂模型组比较均降低(p<0.05),给予葡萄糖1 h至2.5 h期间,高脂模型组小鼠血糖值皆明显高于正常饮食组(p<0.01),竹节参总皂苷处理后,各用药组血糖值均低于高脂模型组(p<0.05或p<0.01),各用药组的血糖值变化曲线均位于正常饮食组和高脂模型组之间。(4)与正常饮食组比较,高脂模型组小鼠血清中葡萄糖、TG、TC、LDL-C的含量明显上升(p<0.05),HDL-C的含量明显降低(p<0.05);与高脂模型组相比,各用药组小鼠血清中的葡萄糖、TG、TC、LDL-C的含量均降低,其中葡萄糖的降低有统计学意义(p<0.05),HDL-C的含量升高。(5)HE染色结果显示,正常饮食组脂肪细胞排列紧密,大体呈圆形,大小均一;高脂模型组小鼠脂肪细胞结构紊乱、大小不均,与正常饮食组比较,巨噬细胞浸润形成的牙套状结构显著增加(p<0.01),脂肪细胞体积增大;与高脂模型组比较,各用药组中高脂饮食所致的巨噬细胞浸润减少(p<0.05),细胞体积减小,细胞形态明显改善。(6)实时定量PCR结果显示,与正常饮食组比较,高脂模型组小鼠脂肪组织中TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-1的mRNA表达水平显著升高(p<0.01);与高脂模型组比较,给予竹节参总皂苷干预后,各用药组小鼠脂肪组织中TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-1的mRNA表达水平显著降低(p<0.05)。(7)Western blot实验结果显示,与正常饮食组比较,高脂模型组小鼠脂肪组织中TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表达水平显著升高(p<0.01);竹节参总皂苷干预后,各用药组TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表达水平均降低(p<0.05)。(8)Western blot实验结果显示,与正常饮食组比较,高脂模型组小鼠脂肪组织中pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB的蛋白表达水平显著升高(p<0.01);竹节参总皂苷干预后,各用药组小鼠脂肪组织中pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB的蛋白表达水平均降低(p<0.05)。其中,正常饮食组、高脂模型组及各用药组的总NF-κB、IκB、核转录因子-κB抑制蛋白激酶(Nuclear factor-κB-inhibitorκB kinase,IKK)的蛋白表达水平没有明显差异。(9)实时定量PCR结果显示,与正常饮食组比较,高脂模型组小鼠脂肪组织中F4/80、CD11b的mRNA表达水平显著升高(p<0.01);与高脂模型组比较,各用药组F4/80、CD11b的mRNA表达量均显著降低(p<0.01)。(10)流式细胞术分选结果显示:高脂模型组内脏脂肪组织中巨噬细胞的比例高于正常饮食组,而各用药组经竹节参总皂苷处理后其内脏脂肪组织中巨噬细胞比例均减少。2,体外实验:(1)成功将3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞,成熟脂肪细胞中的脂滴经油红O染成红色;(2)MTT结果显示,当竹节参总皂苷浓度高于50μg/ml时细胞的增殖受到明显抑制(p<0.05或p<0.01);药物浓度低于50μg/ml,细胞的增殖则不受影响;因此我们将后续细胞实验的安全药物浓度定为50μg/ml;(3)Western blot结果显示,与空白对照组比较,用PA处理过的模型组中相关炎症因子TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表达水平明显升高(p<0.01),竹节参总皂苷干预后其表达量降低(p<0.05);(4)Western blot结果显示,模型组pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB的蛋白表达水平明显高于空白对照组(p<0.01),而与模型组比较,竹节参总皂苷处理组pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB蛋白表达水平降低(p<0.01),其中,空白对照组、模型组及各用药组的总NF-κB、IκB、IKK的蛋白表达水平没有明显差异。结论:竹节参总皂苷可明显改善高脂饮食所致的脂肪组织慢性炎症和PA诱导的成熟脂肪细胞炎症,其作用机制与减少脂肪组织巨噬细胞浸润、抑制巨噬细胞向促炎型巨噬细胞极化、抑制脂肪组织及成熟脂肪细胞中的NF-κВ炎症通路有关。